胶原酶与自体血建立脑出血模型的比较研究

陈　炜，黄树武，高玉广，何　青，何乾超，黄德庆，张元侃，刘　泰

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西　南宁　530023；2.广西中医药大学，广西　南宁　530000）

胶原酶与自体血建立脑出血模型的比较研究

陈炜1，黄树武1，高玉广2，何青2，何乾超1，黄德庆1，张元侃1，刘泰1

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023；2.广西中医药大学，广西南宁530000）

目的比较胶原酶脑出血模型与自体血脑出血模型的稳定性。方法分别采用胶原酶和自体血注入大鼠尾状核建立脑出血模型，比较两组模型死亡率、神经功能缺陷评分、脑组织水含量、血肿大小、神经元细胞凋亡的差异。结果假手术组术后神经功能缺陷评分、脑水含量、血肿体积、神经元细胞凋亡数量未见明显变化；胶原酶组成功率高于自体血组（P＜0.05）；两组死亡率基本一致。胶原酶模型组24 h、3 d、7 d时间点神经功能缺陷、脑水含量、血肿体积、神经元细胞凋亡数量均明显高于自体血模型组（P＜0.05）。结论胶原酶脑出血模型较自体血脑出血模型稳定。

胶原酶；自体血；脑出血模型；神经功能缺陷；凋亡

脑出血（ICH）具有起病急、病情变化快、病死率高、致残率高、再次出血率高等特点［1］。脑出血在西方国家约占急性脑卒中的15％，而在亚洲国家则高达20％～30％［2］。脑出血不仅发病率高，也是最严重、破坏性最强的脑卒中类型，其病死率高达30％～50％，而几乎一半的生存者则会留下永久性的残疾［3，4］，给患者和社会带来沉重的负担。脑出血的病理生理是一个复杂的过程，由于在人体直接研究脑出血的损伤机制及防治方法有限，故脑出血动物模型是国内外研究脑出血疾病的必要工具，且研究脑出血的损伤机制、神经功能的恢复以及相关的治疗策略须选择适合的模型。本文比较自体血脑出血模型与胶原酶脑出血模型的稳定性，为研究脑出血的损伤机制提供合适的动物模型。

1　材料与方法

1.1仪器和主要试剂脑立体定位仪（ST-4ND，成都仪器厂）；电子分析天平（AR2140，美国Ohaus公司）；恒冷冰冻切片机；单反数码照相机（佳能EOS550D）；TUNEL试剂盒（批号：11684817910，Roche公司）；胶原酶Ⅶ（批号：SLBG8830V，美国Sigma公司）；PBS缓冲液（pH 7.2～7.4）、0.01 mol·L-1枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）、DAB显色试剂盒（博士德生物技术有限公司）。

1.2实验动物与分组清洁级健康20～22月龄雄性SD大鼠135只，购自广西医科大学实验动物中心（动物合格证号：SCXK桂2009-0002）。

1.3动物分组及模型的复制135只SD大鼠采用计算机产生随机序列。随机分出假手术组（45只）、胶原酶组（45只）、自体血组（45只）。每组分4个观察时点，分别为手术后6 h、24 h、3 d、7 d。其中6 h、24 h、7 d每组大鼠各为10只，3 d每组大鼠各为15只。①自体血组：大鼠术前4 h禁食，2 h禁水，经10％水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于立体定位仪上。于前囟后1 mm，右侧3 mm处钻一直径约1 mm的小孔，垂直进针6 mm，使用微量注射器从大鼠心脏抽取50 μL自体血，在10 min内缓慢注入到右侧尾状核，注入后停针5 min，缓慢退针；②胶原酶组：大鼠术前4 h禁食，2 h禁水，经10％水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，参照Gary等［5］的方法，固定于立体定位仪上，使前囟和后囟在同一水平面上。于前囟后1 mm，右侧3 mm处钻一直径约1 mm的小孔，使用立体定位仪上的微量注射器进针6 mm，即为右侧尾状核的位置。在10 min内注入胶原酶Ⅶ0.5U，注入完毕后停针5 min，缓慢退针；③假手术组：建立方法基本同胶原酶脑出血模型，但以等量生理盐水代替胶原酶。

根据Longa′s的5级标准评分法判定模型成功与否。0分：正常，未见任何神经功能缺损表现；1分：垂直提起时前爪不能伸直；2分：行走时身体向左倾，向左侧旋转；3分：行走时身体向左侧跌倒；4分：不能自发行走或有意识障碍。通过此评分挑选合格动物模型，评分在1～3分为合格。大鼠脑出血模型建立后，如有以下情形者予以剔除：神经学症状评分低于1分或为4分者；取脑组织时发现蛛网膜下腔出血者；脑组织石蜡切片HE染色无出血病理学改变者；未到实验规定时间自动死亡者。因上述原因导致实验动物不足时，通过随机抽样原则补齐。

1.4神经功能缺损评分各亚组大鼠分别与造模前前1天及以后的每个时间点进行神经功能缺损评分。参照Gareia［6］评分法进行神经功能缺损程度评分，最低3分，最高18分，分数越高则神经功能损害越轻，分数越低则神经功能损害越重。

1.5取材与处理各组术后清醒大鼠按时间点以Gareia评分法进行神经功能缺损评分后断头处死，剥离大脑组织，取出血侧脑组织一部分进行脑水含量的测定。另一部分置于4％甲醛溶液中固定保存，制作石蜡切片后用TUNEL法检测神经元凋亡。

1.6脑含水量测定不同组别、不同时间点麻醉大鼠，断头处死，迅速取出脑组织，用刀片以针尖为中心取厚度约4 mm出血侧脑组织，立即称湿重。将组织放入烘干箱100℃烘烤24 h再称干重。按Elliot公式计算脑组织含水量：脑组织含水量（％）=（湿重-干重）/湿重×100％。

1.7血肿体积的测量取第3天时间点，每组取5只大鼠，断头取脑，经4％多聚甲醛固定脱水后以注射针道为中心做冠状切片，厚度约1 mm，用数码相机拍摄切片后用ImageJ2x软件测量病灶面积，血肿体积则为病灶面积×层数。

1.8TUNEL法检测神经元凋亡步骤：①脱蜡；②4％的多聚甲醛室温固定；③PBS室温浸洗5 min，重复1次；④微波热修复；⑤加TUNEL反应混合液。盖上覆膜，37℃1 h；⑥移去覆膜，PBS室温浸洗5 min×2次；⑦加Converter-POD反应液。盖上覆膜，37℃ 30 min；⑧移去覆膜，PBS室温浸洗5 min ×2次；⑨加DAB显色液室温反应约10 min；⑩透明封片，400倍镜检。

1.9统计学方法使用SPSS 19.0进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐则行LSD（L）检验，方差不齐则取Tamhane′s T2检验结果，计数资料采用χ2检验，P＜0.05具有统计学意义。

2　结果

2.1造模成功率及死亡原因各组大鼠术后2 h进行行为学评定。造模成功的大鼠左侧肢体可见不同程度瘫痪，表现为左侧前肢屈曲蜷缩，行走时向左侧倾倒或左侧转圈，重者不能行走并出现伴意识障碍。无症状者或在未达到最短取材时间点死亡的大鼠均为造模失败。

假手术组48例，其中3例麻醉意外死亡；胶原酶组大鼠56只，其中死亡8只，无症状3只，造模成功45只，成功率80.4％；自体血组大鼠70只，其中死亡10只，无症状者15只，造模成功45只，成功率64.3％（详见表1）。大鼠死亡原因为麻醉意外、呼吸心跳骤停、蛛网膜下腔出血（SAH）、脑疝形成、感染（详见表2）。通过对胶原酶组和自体血组的造模成功率和死亡率进行统计分析，结果发现，胶原酶组成功率高于自体血组（P＜0.05），两组间死亡率无统计学差异（P＞0.05），死亡原因各组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。

表1　各组模型建立情况

表2　各组大鼠死亡原因

2.2神经功能缺损评分脑出血大鼠清醒后，假手术组未出现明显神经功能缺损，胶原酶组和自体血组出现不同程度的神经功能缺损，于3 d达到高峰。胶原酶组与自体血组6 h时间点神经功能缺损评分差异无统计学意义（P＞0.05）。胶原酶组24 h、3 d、7 d时间点神经功能缺损评分低于自体血组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

x±s，n=10）表3 各组大鼠脑出血后各时间点神经功能缺损评分情况（

2.3脑含水量测定大鼠脑出血术后不同时间点血肿周围脑组织含水量的变化如表4所示。胶原酶组和自体血组各时间点的脑组织含水量与假手术组比较均有明显升高（P＜0.05）；24 h以后胶原酶组脑含水量明显高于自体血组（P＜0.05）。

表4　各组大鼠脑出血后各时间点脑含水量（％±s，n=10）

表4　各组大鼠脑出血后各时间点脑含水量（％±s，n=10）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与胶原酶组同一时间比较，▼P＜0.05

组别6 h　24 h　3 d　7 d假手术组　76.30±1.06　77.80±1.81　78.20±1.55　76.40±1.17胶原酶组　79.50±4.32*　85.30±1.70　88.10±2.08　84.20±1.40自体血组　80.04±1.34*　83.10±1.20▼　84.20±1.87▼　81.90±1.10▼

2.4血肿体积比较术后第3天，假手术组未见明显血肿，胶原酶组血肿不规则，呈弥漫性。自体血组血肿较规则，血肿体积较胶原酶组小，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1　3 d血肿体积大小

2.5神经元凋亡情况 各时间点每组随机取5个视野进行观察，阳性细胞被染成棕褐色，正常或正在增殖的细胞不被染色，假手术组见少量凋亡细胞，胶原酶组和自体血组各时间点阳性细胞数与假手术组比较有统计学差异（P＜0.05），胶原酶组、自体血组24 h、3 d、7 d与6 h时间点比较有统计学差异（P＜0.05）。胶原酶组24 h、3 d、7 d时间点细胞亡数量与自体血组比较差异有统计学差异（P＜0.05）（见表5、图2）。

表5　各组大鼠神经元凋亡情况（x±s）

图2　3 d时间点各组细胞凋亡情况（×400）

3　讨论

脑出血动物模型常见的有自体血注入法、胶原酶注入法、脑内植入填充物法及自发性脑出血模型［7］。由于脑内植入填充物法不能模拟脑出血病理生理特点［8］，自发性脑出血模型存在出血量及出血部位不稳定等缺陷［9］，这两种方法限制其在实验研究中的应用，因此近年已基本不使用。目前常用的方法是自体血注入法及胶原酶诱导的脑出血［10］，然而这两种造模方法各有优缺点。自体血诱导的脑出血模型可能接近于人类自发性脑出血的病理生理特点，适合用于研究脑出血后脑水肿形成继发性脑损害的病理生理机制。但其取血困难，常用的有股动脉取血、心脏取血和颈动脉取血，但操作繁琐，动物死亡率高，采血时间过长容易导致凝血，血液从针孔反流导致血肿大小不稳定［11］，且股动脉取血影响大鼠的运动功能评分。本实验动物采用20～22月龄SD大鼠，体重450～520 g，具有性情温和、容易饲养、造模成本低廉等特点，大鼠神经系统结构和功能与人类相似，且老年大鼠的生理与人类发病年龄相符，接近临床脑出血的特点。

脑出血后脑水肿的产生既有细胞毒性水肿，也有血管源性水肿形成，张扬等［12］认为：脑出血6 h内脑水肿属于细胞外水肿，原因是血肿压迫周围脑组织致局部微循环障碍，细胞器损伤，同时血肿、血块回缩，释放血浆和白蛋白，使间质内胶体渗透压升高，通过渗透压及流体静力压形成早期脑水肿；脑出血后第2天由于凝血酶以及凝血级联反应会引起脑血管痉挛及星型胶质细胞损伤，此时期引起细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿；此外，红细胞裂解物也可导致脑血管和脑组织神经元和胶质细胞损伤，引起脑水肿加重。有研究认为［13］，高血压早期强化降压治疗可显著减少脑出血患者血肿扩大、减轻脑水肿发生率，恢复和改善神经功能，实验研究发现［14］，脑出血后AQP-4、IL-6及 MMP-9过度表达与脑细胞水肿具有正相关性。神经元细胞凋亡的检测是常被用于评价药物治疗脑出血疗效的指标之一［15］。

本实验研究发现胶原酶注入法和自体血注入法两组大鼠死亡率无差异，但是胶原酶组成功率高于自体血组，而且胶原酶组具有操作简便、重复性好、血肿大小稳定等优点。因此，胶原酶注入法建立的脑出血模型适合用于评价药物对脑出血后的治疗效果的研究。

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Comparative study on the model of intracerebral hemorrhage of collagenase and autologous blood establishment

CHEN Wei1，HUANG Shu-wu1，GAO Yu-guang2，HE Qing2，HE Qian-chao1，
HUANG De-qing1，ZHANG Yuan-kan1，LIU Tai1
（1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China；2.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530000，China）

Objective To compare the stability of collagenase model and autologous blood cerebral hemorrhage.Methods The model of intracerebral hemorrhage（ICH）was established by collagenase and autologous blood into caudate nucleus in rats.The model mortality，neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosis were choosed to detect the difference of two models.Results No significant difference of the neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosis after operation in sham operation group；The model success rate in collagenase group was obviously higher than the autologous blood group（P＜0.05）；The model mortality had no difference in two groups.At 24 h，3 d，7 d times，the neurological deficit score，brain water content，the size of hematoma and the number of neuronal apoptosisn of collagenase group were all higher than the autologous blood group（P＜0.05）.Conclusion The ICH model of rats established by collagenase was a stable model.

Collagenase；Autologous blood；Intracerebral hemorrhage model；Neurological deficit score；Apoptosis

R965.1

A

2095-5375（2015）12-0692-004

广西自然科学基金项目资助（No.2013GXNSFAA019125）

陈炜，男，主治医师，研究方向：脑血管疾病中医药防治，E-mail：liutai590216@163.com

刘泰，男，主任医师，教授，研究生导师，研究方向：神经系统疾病，特别是脑血管疾病的中西医结合临床、科研和教学工作，Tel：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com