HPLC法测定乳痛安口服液中连翘苷的含量

邰晓鹏，臧恒昌

（1.山东大学药学院，山东　济南　250012；2.山东省泰安市中心医院药学部，山东　泰安　271000）

HPLC法测定乳痛安口服液中连翘苷的含量

邰晓鹏1，2，臧恒昌1

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东省泰安市中心医院药学部，山东泰安271000）

目的建立乳痛安口服液中连翘苷的含量测定方法，为其质量标准提高提供依据。方法采用反相高效液相色潽法测定乳痛安口服液中连翘苷的含量，并进行一系列方法学考察。色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×150 mm，5 μm）；柱温：25℃；流动相：乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：277 nm。结果连翘苷在0.625～10.00 μg·mL-1范围内线性关系良好（r=1.000 0），乳痛安口服液供试品的稳定性以及所建立定量方法的专属性、重现性、精密度、加样回收率均符合要求，3个批次的乳痛安口服液中连翘苷的含量分别为14.78、15.31、15.40 μg·mL-1。结论所建立的测定方法简便、稳定、专属性强、可重复性好，可以用于乳痛安口服液的质量控制。

乳痛安口服液；连翘苷；高效液相色谱法；含量测定；质量标准

乳痛安口服液为泰安市中心医院院内制剂，是由连翘、黄芩、当归等10余味中药材组成，具有理气、散结、止痛等功效，我院临床用于乳腺增生、乳腺炎的治疗，临床疗效确切可靠。连翘［Forsythia suspensa（Thumb.）Vahl］作为方中君药，连翘苷是其主要成分之一，原标准仅采用薄层色谱法对其进行鉴别，无法满足该制剂的质量控制要求。为更有效的控制该制剂的质量，本文参考《中国药典》2010年版（一部）连翘中连翘苷的含量测定方法［1］，以及文献报道的其他中药复方制剂中连翘苷含量测定方法［2～5］，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定该制剂中连翘苷的含量，以提高该制剂的质量标准。

1　仪器与试药

1.1仪器岛津高效液相色谱仪（LC-10A），包括SPD-10 AVP紫外检测器（日本岛津公司）；TG3288型分析天平（上海天平仪器厂）。

1.2试剂与试药连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110821-200406）；乳痛安口服液（泰安市中心医院制剂室，批号：140715、140722、140729）；水为超纯水，甲醇、乙腈均为色谱纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm× 150 mm，5 μm）；柱温：25℃；流动相：乙腈-水（25 ∶75）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：277 nm；数据采集时间：20 min；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3 000。连翘苷的保留时间为10.01 min，与其他组分分离良好，连翘苷标准品、乳痛安口服液高效液相色谱图见图1、2。

图1　连翘苷标准品高效液相色谱图

图2　乳痛安口服液高效液相色谱图

2.2线性关系考察精密称取连翘苷对照品适量于标准配制瓶中，加入一定体积甲醇溶解，制得浓度为0.25 mg·mL-1的连翘苷标准溶液，精密吸取适量，以甲醇稀释5倍得50 μg·mL-1连翘苷储备液。精密吸取上述50 μg·mL-1连翘苷储备液，分别以甲醇稀释5倍和10倍，得10 μg·mL-1和5 μg·mL-1的连翘苷储备液，以该两种储备液进行适当稀释得浓度0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 μg·mL-1的对照品工作溶液。上述工作溶液按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，测定峰面积积分值，并以峰面积积分值（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归，得回归方程为A=59.079C+2 024.3（回归系数r =1.000 0），线性范围为0.625～10.00 μg·mL-1，具体见表1。

2.3供试品溶液制备精密量取乳痛安口服液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，振摇，以甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4专属性考察取处方中连翘以外的其他中药，按乳痛安口服液工艺，制得阴性对照品溶液。照供试品溶液的制备方法，按“2.1”项下色谱条件进行测定，用于考察乳痛安口服液中连翘苷含量测定方法的专属性，结果表明，在“2.1”项下色谱条件下，连翘苷保留时间附近未见明显色谱峰，表明乳痛安口服液中的其他组分对测定无干扰，结果见图3。

图3　阴性对照品溶液高效液相色谱图

2.5稳定性试验取乳痛安口服液样品（批号：140415），按“2.3”项方法制备成供试品溶液，置于室温下，按“2.1”项下色谱条件分别于0、3、6、12、24、48 h进行HPLC分析，进样量10 μL，测定连翘苷峰面积积分值并计算RSD值为1.95％，表明供试品在室温放置的48 h内是稳定的。

2.6精密度试验取0.625、2.50、10.00 μg·mL-13个浓度的连翘苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件各重复进样5次，进样量10 μL，测定连翘苷峰面积积分值并计算RSD值分别为1.89％、1.77％、1.26％，表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验取同一批次乳痛安口服液样品（批号：140415）5份，分别按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样平行测定，进样量10 μL，测定连翘苷峰面积积分值并计算RSD值为1.58％，表明本方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验精密吸取同一已知连翘苷含量的乳痛安口服液2.5mL，共9份，分3组，每浓度3份，分别准确加入250 μg·mL-1连翘苷对照品溶液100、160、300 μL。按“2.3”项下方法制备成供试品溶液后，按“2.1”项下色谱条件进样平行测定，进样量10 μL，测定连翘苷峰面积积分值并计算结果，连翘苷的平均回收率为100.77％，见表1，表明本方法的加样回收率高，样品在处理的过程中基本没有损失，所建立定量方法测得结果是准确的。

表1　加样回收率实验结果

2.9样品的含量测定精密吸取3个批次的乳痛安口服液各5 mL，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，进样量10 μL，测定连翘苷峰面积积分值并按“2.2”项下所建立标准曲线定量连翘苷含量（每批样品重复3份），结果详见表2。

表2　乳痛安口服液中连翘苷的含量测定结果

3　讨论

作为我院重要的院内制剂，乳痛安口服液具有理气、散结、止痛等功效，在我院临床用于乳腺增生、乳腺炎的治疗，疗效确切可靠。按中药复方组方原理，连翘为乳痛安口服液的君药，中医记载其能清热解毒、消肿散结、疏散风热，现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤［6］、抗炎镇痛［7］、抗菌［8］、抗病毒［9］、抗内毒素［10］、清除自由基［11］等药理作用。其中，连翘苷为连翘的主要成分之一，其可通过抑制MAPK与NF-κB的激活来发挥抗炎作用［12］。

乳痛安口服液含有多种中药，对于成分复杂的中药复方体系，通常采用定量检测中药复方中一种或多种有效成分的方法来进行中药复方的质量控制。对于乳痛安口服液，可以通过检测其主要活性成分连翘苷含量的方法来控制其质量。

然而，由于中药复方复杂成分的干扰，需要选择适当的样品处理方法，以除掉部分杂质。曾有文献［13］使用乙酸乙酯萃取和过中性氧化铝柱的方法进行含连翘苷合剂的处理，该方法虽然能够除掉大量杂质，但操作繁琐，并且会造成连翘苷的损失［5］。本研究所用方法中，只需要用甲醇沉淀法将药液中所含的蛋白、多糖等水溶性成分除掉，这些成分可能会损伤反向高效液相色谱柱，处理后的样品可直接用于进样分析，通过HPLC条件的摸索实现连翘苷与杂质的分离以及连翘苷的含量测定。本方法操作简便，加样回收率数据显示样品处理的过程中几乎无连翘苷损失，并且简便、稳定、专属性强、可重复性好，可以用于乳痛安口服液的质量控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：381-382.

［2］张庆伟，王润岭，李惠芬，等.抗病毒口服液中连翘苷的含量测定［J］.中草药，2001，32（9）：804-805.

［3］孔宪平.清热解毒口服液中连翘苷的含量测定［J］.中国医药指南，2008，6（22）：171-172.

［4］潘军.RP-HPLC法同时测定复方黄柏液中盐酸小檗碱、绿原酸和连翘苷的含量［J］.齐鲁药事，2009，28（9）：524-526.

［5］迟芳振，李玲.清热解毒片中连翘苷的含量测定［J］.医学信息（上旬刊），2011，24（9）：6139-6140.

［6］张明远，郑福禄，栗坤，等.连翘醇提物对H22肝癌小鼠的抑癌作用［J］.中国误诊学杂志，2008，8（22）：5322-5323.

［7］胡竟一，雷玲，余悦，等.连翘的抗炎解热作用研究［J］.中药药理与临床，2007，23（3）：51-52.

［8］牛新华，邱世翠，邸大琳，等.连翘体外抑菌作用的研究［J］.时珍国医国药，2002，13（6）：342-343.

［9］胡克杰，徐凯建，王跃红，等.连翘酯甙体外抗病毒作用的实验研究［J］.中国中医药科技，2001，8（2）：89.

［10］韩双红，王玉芬，张居馨，等.连翘败毒片的抗内毒素及免疫调节作用研究［J］.天津中医药，2004，21（5）：417-419.

［11］涂秋云，周春山，汤建萍，等.连翘乙醇提取物清除脂自由基和氧自由基的效果［J］.湖南农业大学学报（自然科学版），2008，34（6）：728-731.

［12］Zhong WT，Wu YC，Xie XX，et al.Phillyrin attenuates LPS-induced pulmonary inflammation via suppression of MAPK and NF-κB activation in acute lung injury mice ［J］.Fitoterapia，2013，90：132-139.

［13］李会勤.清喉咽合剂中连翘苷的含量测定［J］.当代医学，2011，17（3）：51-52.

Determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution by HPLC

TAI Xiao-peng1，2，ZANG Heng-chang1
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Pharmacy，Taian Central Hospital of Shandong Province，Taian 271000，China）

Objective To establish a method for determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution and to develop a new quality standard.Methods An RP-HPLC method was adopted for the determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution.The HPLC conditions were as follows：Diamonsil C18（4.6mm×150 mm，5 μm）column was used with column temperature 25℃；A mixture of acetonitrile-H2O（25∶75）served as mobile phase with flow rate 1.0 mL·min-1；The injection volume was 10 μL；The detection wavelength was 277 nm；The data acquisition time was 20 min and the theoretical plate number of phillyrin was over 3 000.Results The phillyrin showed a good linearity in the range of 0.625～10.00 μg·mL-1（r=1.000 0）.The stability for samples extracted from Rutong′an Oral Solution，as well as the specialization，reproducibility，precision and recovery for the established quantitative method were in line with the requirements.The contents of phillyrin in the 3 batches of Rutong′an Oral Solution samples were 14.78，15.31，15.40 μg·mL-1，respectively.Conclusion The established method was simple，stable with strong specificity and good repeatability，and can be applied for quality control of Rutong′an Oral Solution.

Rutong′an Oral Solution；Phillyrin；HPLC；Determination；Quality standard

R927.2

A

2095-5375（2015）12-0703-003

邰晓鹏，男，研究方向：医院制剂检验、研究，E-mail：1252443436@qq.com

臧恒昌，男，教授，硕士生导师，研究方向：多糖类药物研究、药品生产工艺优化与在线过程分析与过程控制，Tel：0531-88380268，E-mail：zanghcw@126.com