丁苯酞预处理对脑缺血再灌注大鼠海马微血管构筑和自由基代谢的影响

2015-11-17郑小影孔维赵淑敏纪海茹陈萌马卫军韩莉刘胜

天津医药 2015年8期

郑小影，孔维，赵淑敏，纪海茹，陈萌，马卫军，韩莉，刘胜

郑小影，孔维，赵淑敏△，纪海茹，陈萌，马卫军，韩莉，刘胜

目的观察局灶性脑缺血再灌注时大鼠海马微血管构筑和自由基代谢的变化，探讨丁苯酞对其影响。方法54只SD大鼠按随机数字表法分为丁苯酞预处理组、缺血再灌注组和假手术组，每组18只。线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型，观察神经功能缺损评分和梗死体积；单宁酸-氯化铁（TA-Fe）媒染法显示海马微血管，定量分析微血管密度（MVD）和微血管面积密度（MVA）；比色法检测海马组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果与缺血再灌注组相比，丁苯酞预处理组神经功能缺损评分和梗死体积均减少，SOD活性升高、MDA含量下降，微血管数量增多，分支吻合成网，MVD和MVA值明显升高（P＜0.01）。结论丁苯酞可改善海马微血管分布，减轻自由基损伤，对局灶性脑缺血再灌注损伤有一定的预防性保护作用。

再灌注损伤；海马；超氧化物歧化酶；丙二醛；丁苯酞；微血管密度；微血管面积密度

随着社会的发展和生活节奏的加快，急性脑梗死患者逐年增多且呈现年轻化趋势。其病理生理基础主要是脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia re⁃perfusion injury，CIRI），这使寻找可靠药物来抑制CIRI成为国内外医生面临的主要难题之一。丁苯酞（3-n-butylphthalide，商品名恩必普，NBP）已被证明对CIRI有较好的治疗作用［1］。但其作为预防用药的效果和机制尚有待进一步研究。本文通过观察大鼠脑缺血再灌注时海马微血管分布和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）代谢情况，探讨丁苯酞对急性脑梗死的预防性保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与分组54只SPF级SD大鼠购自天津医科大学实验动物中心，体质量200～240 g，按随机数字表法分为丁苯酞预处理（NBP）组、缺血再灌注（IR）组和假手术（Sham）组，每组18只。丁苯酞购自石药集团恩必普药业有限公司。NBP组给予40 mg·kg-1·d-1灌胃，Sham组和IR组给等容积的生理盐水，共7 d。Mivnt图像分析系统（山东）；SOD、MDA、DAB显色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；单宁酸、氯化铁（市凯通化学试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠缺血再灌注模型制备大鼠适应性饲养1周后，各组大鼠灌胃7 d，准备渔线（一端涂凡士林，一端用记号笔做好标记备用）。术前12 h禁食、自由饮水，IR组和NBP组采用Zea-Longa改良线栓法［2］制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）2 h再灌注24 h模型。Sham组仅分离颈总、颈内、颈外动脉，不做插线处理。大鼠苏醒后模型成功标志为：右眼Horner征、行走时向左侧倾倒或转圈和提尾时左前肢屈曲内收。不符合模型要求的剔除，并及时补遗。术后分笼保暖饲养。

1.2.2 神经功能缺损评分参照Longa等［2］评分标准，于脑缺血2 h再灌注24 h时对各组大鼠进行神经功能缺损评分。无神经功能缺损症状0分；不能完全伸展对侧前爪1分；向外侧转圈2分；向内侧倾倒3分；不能自发行走，意识丧失4分。1～3分留用，0分、4分者弃去，并及时补足。

1.2.3 脑梗死体积测定采用TTC染色法。大鼠缺血2 h再灌注24 h时，每组取6只断头取脑。将新鲜的脑组织置于-20℃冰箱中速冻后，沿冠状方向切成片厚约2 mm切片。在培养皿中将切片摆好，倒入2%TTC溶液，37℃恒温箱避光孵育30 min，期间翻动以保证切片均匀着色，甲醛固定后拍照。正常脑组织染成均匀玫瑰红色，梗死区因缺血不着色而呈白色。图像分析系统计算每片的梗死面积，梗死体积即为梗死面积之和与片厚的乘积，以梗死体积/全脑体积比值作为衡量参数。

1.2.4 海马微血管的显示及定量分析再灌注后24 h，每组大鼠取6只，采用含2%单宁酸的混合固定液灌注固定后取脑。震荡切片机连续切片，片厚25 μm，隔2片取1片。TAFe联合媒染法［3］显示海马微血管形态后光镜下观察并拍片。随机读取3个视野，Mivnt图像分析系统定量分析各组大鼠海马的微血管密度（microvesser density，MVD）和微血管面积密度（microvesser aera density，MVA），取平均值。

1.2.5 海马组织SOD活性和MDA含量的测定再灌注24 h后，每组大鼠取6只，断头取脑。在冰盘上将右侧海马从新鲜脑组织分离出来并制成10%匀浆备用。操作流程和方法按试剂盒要求进行。黄嘌呤氧化酶法测SOD活性，硫代巴比妥酸法测MDA含量。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件处理，结果以表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验；2组间比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分Sham组无神经功能缺损，IR组可见明显的右侧Horner征和行走时向左侧转圈现象，见图1、2。与IR组相比，NBP组神经功能缺损症状显著减轻（P＜0.01），见表1。

2.2 各组大鼠脑梗死体积百分比的比较Sham组脑组织染成均匀玫瑰红色，IR组和NBP组均有不同范围的苍白色梗死灶。与IR组相比，NBP组的苍白色范围有较显著的降低（P＜0.01），见表1。

Fig.1Horner symptoms in the right图1 右侧Horner征

Fig.2Circling towards to the left图2 向左转圈

Tab.1Comparision of neurological scores and the infarction volume of rats in all three groups表1 各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积比较（n=6）

＊＊P＜0.01

组别Sham组IR组NBP组t神经功能缺损评分0 2.99±0.36 1.42±0.19 9.431＊＊脑梗死体积（%）0 9.66±0.97 3.99±0.69 11.670＊＊

2.3 大鼠海马微血管显示及定量分析Sham组海马微血管呈现空心管状密集分布，发出分支并相互吻合成网；IR组多数血管扭曲变形或闭合，分支及分支间吻合几乎看不到，MVD、MVA均明显降低，与Sham组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；NBP组的微血管数量和树状分支较多，形态自然，与IR组相比，MVD、MVA均增加（P＜0.01），见表2、图3。

Tab.2Comparison of MVD and MVA in Hippocampus of rats in all three groups表2 各组大鼠海马的MVD与MVA变化（n=6）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与IR组比较，P＜0.01

组别Sham组IR组NBP组F MVD 47.04±3.15 10.88±0.97a 28.66±2.14ab 380.681＊＊MVA 0.118 1±0.012 8 0.025 8±0.007 4a 0.066 8±0.007 7ab 137.898＊＊

2.4 各组大鼠海马组织SOD活性和MDA的含量与Sham组相比，IR组海马组织的SOD活性明显降低，而MDA含量显著升高（P＜0.01）；NBP预处理有效上调了SOD活性，同时下调了MDA含量，与IR组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

Tab.3Changes of SOD and MDA in hippocampus of rats in all three groups表3 各组大鼠海马组织的SOD活性与MDA含量比较（n=6）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与IR组比较，P＜0.01

组别Sham组IR组NBP组F SOD（U·mg-1·pro-1）140.84±3.07 95.22±3.35a 123.59±2.28ab 368.640＊＊MDA（μmol·g-1·pro-1）9.03±0.84 15.10±0.75a 11.41±0.81ab 87.231＊＊

Fig.3Microvascular architecture in hippocampus of rats in all groups（TA-Fe method，×200）图3 各组大鼠海马微血管构筑（TA-Fe媒染法，×200）

3 讨论

急性脑梗死时血流急剧中断可引起神经功能缺损，早期溶栓又会加重这种损伤。因此，通过对动物模型预防用药来减轻或抑制这种缺血再灌注损伤的实验成为医学科研人员一个主要研究方向。研究证实预防性应用中药黄芩茎叶总黄酮可有效减轻大鼠大脑中动脉的CIRI时皮质微血管损伤［4］、提高抗氧化能力，并抑制神经元凋亡［5-6］。纪海茹等［7］应用我国自主研发新药丁苯酞（商品名称：恩必普）预处理局灶性脑缺血再灌注大鼠也证实其可减轻CIRI造成的脑水肿并降低血脑屏障通透性。牛慧艳等［8］研究显示丁苯酞氯化钠注射液治疗临床急性缺血性卒中有较好疗效。但丁苯酞作为临床一级预防用药的依据尚不完善，有待进一步研究。

3.1 NBP对大鼠CIRI时海马微血管构筑的作用脑组织对缺血缺氧非常敏感，海马作为最敏感部位之一，海马微循环因其维持海马血液与神经元间的物质交换而备受关注，微血管的数量、结构和功能的完整性是有效血液供应的保证。CIRI可以破坏毛细血管管壁完整性，从而改变其通透性，引发一系列的病理生理变化。显示微血管的方法很多，而单宁酸-氯化铁法［3］可更好地显示微血管。用其观察缺血再灌注大脑皮质的微血管变化效果良好［4］。MVD、MVA是衡量微循环物质交换功能状态和局部血流量的主要参数，本实验显示Sham组海马管状微血管密集，分支很多且相互吻合成网；而IR组毛细血管很少，分支及分支间的吻合少见，MVD、MVA均明显降低；NBP组的毛细血管数量和分支增多，MVD、MVA均较IR组增加。说明丁苯酞对海马CIRI的保护作用可能与丁苯酞能促进CIRI的脑微血管侧支循环的形成有关，这与以往的报道一致［9］。

3.2 NBP对大鼠CIRI时海马组织自由基代谢的影响CIRI的病理过程涉及许多因素，其中氧自由基占有重要地位。生理状态下机体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡状态，CIRI时产生的大量氧自由基可造成脂质过氧化物蓄积，细胞膜受损，最终引起神经功能缺损［10］。SOD是体内重要的天然抗氧化酶，MDA是由氧自由基引发的脂质过氧化产物，MDA的含量一定程度上可以反映机体的脂质过氧化程度。因此，监测CIRI时SOD活性和MDA含量成为评价此时机体内氧化和抗氧化水平的经典指标。陈萌等［5］发现大鼠CIRI时SOD活性明显下降，而MDA含量大幅上调，说明CIRI时氧自由基致膜脂质等损伤，从而引发一系列的脑细胞功能受损。本文用丁苯酞预处理实验大鼠发现NBP组较IR组SOD活性升高，MDA含量下降，提示丁苯酞可能通过调节自由基代谢来减轻CIRI。

综上所述，本文通过分析丁苯酞预处理对大鼠局灶性CIRI海马的微血管分布和自由基代谢的影响，证实其对CIRI有一定的预防性保护作用，为其成为临床预防用药提供了实验依据。

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（2014-11-24收稿2015-03-07修回）

（本文编辑李鹏）

Effects of 3-n-butylphthalide pretreatment on microvascular architecture and free radical metabolism in hippocampus induced by cerebral ischemia/reperfusion

ZHENG Xiaoying，KONG Wei，ZHAO Shumin△，JI Hairu，CHEN Meng，MA Weijun，HAN Li，LIU Sheng
Basic Medical College，Chengde Medical College，Chengde 067000，China△

ObjectiveTo observe microvascular architecture and free radical metabolism in hippocampus after focal cerebral ischemia/reperfusion and to explore the effect of NBP（3-n-butylphthalide）.MethodsFifty-four SD rats were ran⁃domly divided into NBP pretreatment group，ischemia/reperfusion group and sham operation group（n=18 in each group）.The model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by suture method.The neurological scores were counted and the volume of infarction was measured；TA-Fe method was applied to observe the microvascular architecture of hippo⁃campus，Mivnt image analysis system was used to analyze the microvessel density（MVD）and the microvessel area density（MVA）of hippocampus quantitatively；The activity of SOD and content of MDA were measured by colorimetric method.ResultsCompared to the ischemia reperfusion（IR）group，the neurological scores and the volume of infarction were decreased sharply in NBP group.What′s more，the activity of SOD，MVD and MVA were all enhanced but the content of MDA and the count of closed microvessels were both reduced（P＜0.01）.ConclusionNBP can improve microvascular architecture of hippocampus and reduce the free radical injury.There is a protective effect on hippocampus of rats who suffered focal cere⁃bral ischemia reperfusion.

reperfusion injury；hippocampus；superoxide dismutase；malondialdehyde；3-n-butylphthalide；microves⁃sel density；microvessel area density

R743

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.010

河北省教育厅教育科学计划项目（JYGH2010048）

承德医学院基础医学院（邮编067000）

郑小影（1980），女，硕士研究生，主要从事中枢神经解剖方面研究

△通讯作者E-mail：zhaoshumin-2008@163.com