正交试验法优化超声波提取苦楝果实中川楝素*

2015-11-14裴爱田

西部林业科学 2015年6期

裴爱田

(淄博职业学院，山东淄博255314)

苦楝(Melia azedarach Linn)在中国分布广泛，其果实的产量非常大，川楝素(Toosendanin)是苦楝果实的主要活性成分之一。川楝素具有驱虫、杀虫等功效，同时具有非常好的抗肉瘤效应，能诱导细胞分化、凋亡并抑制人和动物的多种肿瘤细胞繁殖［1］。将川楝素应用于杀虫、制药行业具有非常重要的意义。目前，苦楝果实中川楝素的提取方法主要有浸提法［2］、索氏提取法［3］、超声提取法［4～5］、微波辅助提取法［6］和超临界 CO2萃取法［7～8］等。超声提取法具有设备投资少、操作简单、省时省力、易于掌握和推广等优点，目前已被广泛应用于生物活性物质的提取［9］。正交试验法是一种有效优化提取工艺条件的方法，采用极差分析和方差分析研究各因素之间的相互作用，以较少的试验次数及较短的时间对选择的试验参数进行优化，该方法已广泛应用于生物、化工及食品加工技术的条件优化。裴爱田［10］对苦楝素中川楝素的粗提物稳定性进行了研究，而利用正交试验优化超声波提取苦楝中川楝素未见报道。本研究在单因素试验的基础上，采用无重复试验正交设计和极差分析对超声法提取苦楝果实中的川楝素的工艺条件进行了优化，为进一步开发利用苦楝资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

试验材料苦楝果实购自山东淄博医药商城;川楝素对照品来自中国食品药品检定研究院。95%乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯。试验仪器KQ-300V超声波清洗器型(昆山市超声仪器有限公司);BSA224S-CW电子天平〔赛多利斯科学仪器(北京)有限公司〕;FZ-102中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);RV06-ML旋转蒸发仪(德国 IKA公司);DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 提取溶剂的选择

提取溶剂的选择精密称取过40目筛的苦楝果实粉末6份，每份5 g，分别加入95%乙醇、甲醇、氯仿、水、石油醚、乙酸乙酯100 mL于500 mL三角烧瓶中，置超声波清洗器中提取。超声功率300 W，提取时间10 min，提取液经旋转蒸发仪浓缩后定量转移，并用提取剂定容至一定体积，得样品制备液。样品制备液经液相色谱仪检测，计算川楝素的提取率，根据提取率选择合适的溶剂。

1.2.2 川楝素的定量

称取一定量的川楝素对照品，用甲醇配制成浓度为 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL 的标准系列，在液相色谱仪上进行测定。

测定时的色谱条件为，检测器波长215 nm;C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5μm);柱温25℃;流动相甲醇水溶液梯度洗脱，甲醇︰水在20 min内由40%～100%;流速1mL/min;进样量20μL。

1.2.3 正交试验设计

参照许海燕等［11］的方法为评价指标，以市售苦楝果实为材料，设计4因素4水平的L16(45)正交试验(表1)，研究甲醇浓度、提取时间、料液比、超声波功率对川楝素提取的影响。其中甲醇浓度分别为40%、50%、60%和70%;提取时间分别为20 min、30 min、40 min和50 min;料液比分别为1︰5、1︰10、1︰20和1︰30;超声波功率分别为150 W、200 W、250 W和300 W。

表1 正交试验因素及水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 方法学试验

(1)精密度试验取川楝素对照品溶液，按照方法1.2.2设定的色谱条件下重复进样6次，计算川楝素峰面积的相对标准偏差(RSD)。

(2)重复性试验取同一苦楝果实6份，按照方法1.2.1设定的条件制备供试液，按照方法

1.2.2设定的色谱条件分别测定，测得川楝素的平均含量，计算川楝素含量的RSD。

(3)稳定性试验取同一供试液，室温密闭放置，分别在制备后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h进样，计算川楝素峰面积的RSD。

(4)加标回收率试验准确称取已知含量的苦楝果实样品粉末，共9份，分别准确加入一定量的川楝素对照品，按照方法1.2.1设定的条件制备供试液，按照方法1.2.2设定的色谱条件测定，计算平均回收率及回收率的RSD。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择结果

6种提取溶剂对苦楝果实中川楝素提取率见表2。在相同条件下，不同提取剂对苦楝果实中川楝素的提取率有较大的影响，而且提取的成分也不完全相同，用乙醇作提取剂时，有与川楝素在HPLC仪上难以分开的物质被提取出来，甲醇作提取剂时，提取液中的川楝素能在1.2.2选定的色谱条件下与样品中的其他组分很好地分离。因此，选用甲醇作提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对川楝素提取效率的影响Tab.2 Effect of the toosendanin yield of different solvents

表3 L16(45)正交试验设计结果Tab.3 Results of16(45)orthogonal test

2.2 川楝素最佳提取工艺条件的确定

参照许海燕等［11］的方法，对苦楝果实中川楝素提取工艺条件中甲醇浓度、提取时间、料液比、超声波功率等4因素4水平正交试验结果进行统计分析，结果见表3。

由表3中极差R可以看出，对苦楝果实中川楝素提取率的影响因素由大到小依次是，甲醇浓度＞料液比＞提取时间＞超声波功率。从产率看，甲醇浓度为70%、提取时间20 min、料液比为1 g︰30 mL、超声波功率为200 W时，川楝素的产率最高，据此选定该条件组合为超声波法提取川楝素的最佳工艺条件。正交试验结果方差分析见表4。

表4 正交试验结果方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test

经方差分析可知，利用超声波提取法提取苦楝果实中的川楝素，甲醇浓度对川楝素提取效果有统计学意义。

表5 加标回收率试验结果Tab.5 Results of the recovery test

2.3 方法学实验结果

(1)液相色谱法测定川楝素精密度试验结果

川楝素对照品溶液重复进样6次的峰面积依次是223.357、224.078、226.585、228.973、221.264、227.456，其RSD为1.58%，表明该液相色谱法测定川楝素的精密度良好。

(2)超声波法提取川楝素重复性试验结果同一苦楝果实中川楝素6次测定结果依次是0.32%、0.32%、0.30%、0.31%、0.32%、0.32%，平均含量为0.32%，测定结果的RSD为2.66%，表明超声波法提取苦楝果实中川楝素的重复性良好。

(3)川楝素稳定性试验同一供试液放置不同时间后测得的峰面积依次是118.742、116.578、115.433、114.553、110.256，其 RSD为2.72%，表明川楝素供试液在8 h内稳定。

(4)加标回收率实验苦楝果实中川楝素加标回收率实验结果见表5。从表5可知，该方法的平均回收率为96.89%，回收率的RSD为0.99%，符合分析要求。

3 结论与讨论

川楝素具有驱蛔虫、蛲虫和鞭虫等驱虫功效，也是一种植物源杀虫剂，同时还具有诱导肿瘤细胞分化、凋亡，抑制人和动物的多种肿瘤细胞繁殖的作用，能够阻断突触前传递，抑制多种钾通道等。本项目在通过单因素试验选取了对结果影响较大的4个因素，采用正交设计和极差分析对这4个因素进行了优化，为进一步开发利用苦楝资源提供依据。

(1)本项试验先通过单因素试验探索超甲醇浓度、提取时间、料液比及超声波功率对苦楝果实中川楝素提取率的最佳参数，利用L16(45)正交试验设计得出了提取苦楝果实中川楝素的最佳工艺条件为，甲醇浓度70%，固液比1 g︰30 mL，提取时间20 min，超声功率200 W。在此条件下，苦楝果实中川楝素的提取率为0.32%。

(2)本项试验采用正交设计，具有试验次数少，能在较短时间内对所选的试验参数进行较全面的研究，试验结果具有一定的参考价值和实用价值。

(3)本项试验采用了超声波提取苦楝果实中川楝素，该方法具有效率高、能耗少、无污染、提取成分不被破坏等优点，可以应用于苦楝果实中川楝素的提取。

(4)本项试验采用了液相色谱法测定苦楝果实中的川楝素含量，方法的精密度、稳定性、重复性、加标回收率均良好，表明该方法适合用于苦楝果实中川楝素的提取和测定。

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