猫人参醇提取物对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

曾志 王霞 张丹 魏睦新

（1.南京医科大学第一附属医院，江苏南京 210029；2.南京医科大学中西医结合研究所，江苏南京 210029）

猫人参醇提取物对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

曾志1，2王霞2张丹2魏睦新1，2

（1.南京医科大学第一附属医院，江苏南京 210029；2.南京医科大学中西医结合研究所，江苏南京 210029）

目的：探讨猫人参醇提取物对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其作用机制。方法：制备猫人参醇提取物。以人胃癌细胞系SGC-7901细胞株为研究对象，将不同浓度的猫人参醇提取物作用于SGC-7901细胞，通过CCK8法检测猫人参醇提取物对胃癌细胞增殖的影响。采用DAPI荧光染色，观察经100mg/mL猫人参醇提取物处理后SGC-7901细胞形态学的变化。结果：CCK8实验结果显示，与阴性对照组比较，经猫人参醇提取物100、200mg/mL作用12、24、48h后，SGC-7901细胞存活率显著降低（P＜0.05）。经过100mg/ml猫人参醇提取物处理24h后SGC-7901细胞贴壁疏松，密度变低，细胞变扁长，形状不规则，经过DAPI染色后可见细胞核边缘残缺，染色质聚集，并伴有细胞核固缩或断裂现象及出现凋亡小体。结论：猫人参醇提取物对胃癌细胞7901增殖具有抑制作用，是具有治疗前景的抗肿瘤药物。

猫人参 植物提取物 胃癌 SGC-7901 细胞增殖 病理学

胃癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国发病率呈上升趋势。每年世界范围内近100万人被诊断为胃癌，70万人死于胃癌［1］，致死率高于其他临床常见的恶性肿瘤，排在我国恶性肿瘤和致死因素的第四位［2］。猫人参是猕猴桃科植物对萼猕猴桃（Actinidia valvata）或大籽猕猴桃（A.macrosperma）的干燥根及粗茎，其中对萼猕猴桃产自安徽、浙江、湖北、湖南等省份，福建省建宁等地亦有分布，大籽猕猴桃产于广东、湖北、江西、浙江、江苏、安徽等省份［3］。在民间，猫人参用于治疗深部脓肿、骨髓炎、风湿痹痛、疮疡肿毒等常见外科疾病。现代医学临床主要用其治疗消化道肿瘤、原发性肝癌以及肺癌［4］。既往研究表明，单味猫人参注射液对肝癌、白血病及结肠癌细胞株有一定的抑制作用，从猫人参中提取分离而来的葸醌类和皂苷类的复合物均被证实有抗肿瘤活性，能够抑制小鼠皮下移植瘤的生长。本实验通过猫人参醇提取物作用于SGC-7901细胞，探讨其抗癌作用和机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂RPMI-1640培养基（Gibco公司），胎牛血清FBS及胰酶蛋白（HyClone公司），人胃癌细胞株SGC-7901（中科院上海细胞库），CCK8（Gibco公司），细胞计数CCK8试剂盒（碧云天生物科技有限公司），磷酸盐缓冲液PBS（北京中衫金桥生物技术有限公司）。猫人参醇提取物参考张亚妮等［5］的提取方法，由江苏省医药公司提供。

1.2 仪器酶标仪（美国，Thermo Scientific Multiskan FC），二氧化碳培养箱（美国，Thermo Fisher），倒置相差显微镜（德国，徕卡DM500/DM750显微镜），96孔培养板（美国Corning公司），Mill-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

2 实验方法

2.1 猫人参醇提取物的备制取猫人参药材粗粉20kg（本研究所使用的猫人参产自江苏省，选用大籽猕猴桃干燥根及根茎部分），购自江苏省药物研究所，经江苏省药物研究所鉴定，符合《江苏省中药饮片炮制规范》。猫人参粗粉用8倍体积80%乙醇作为提取溶剂回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过得醇提取液，减压回收溶剂得浸膏。将浸膏冷冻干燥呈粉末，精密称取干燥粉末，用培养基制成10mg/mL母液，过0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃备用。

2.2 细胞培养人胃癌细胞株SGC-7901在含10%的胎牛血清1640、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的培养液中生长，并置于37℃、5%CO2相对饱和湿度的孵育箱中培养，细胞呈贴壁生长，取对数生长期的细胞进行实验。

2.3 CCK8法检测肿瘤细胞存活率选取对数生长期SGC-7901细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，将细胞密度调整为5×104个/mL，每孔接种100μL细胞悬液于96孔板中，置于37℃、5%CO2孵育箱中过夜，至细胞完全贴壁，分别加入猫人参醇提取物稀释液，浓度分别为50、100、200mg/mL，每组设5个复孔，对照组加入相同体积培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度下的培养箱内继续培养12、24、48h［6］。终止培养前1h，每孔加入100μL CCK8溶液，混匀，在细胞培养箱继续孵育1h后，弃上清，加入PBS，室温低速震荡10min，待结晶物溶解后，以酶标免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度（A），计算细胞存活率。

2.4 DAPI染色观测肿瘤细胞核的形态学变化将对数期SGC-7901细胞接种于6孔板中，培养过夜，待细胞贴壁生长良好，加入终浓度为100mg/mL的猫人参醇提取物，对照组用等体积的PBS代替，37℃、5%CO2培养24h后收集细胞，等预冷的PBS洗涤后重悬于固定液中30min，之后将悬液低速离心，收集沉淀，用同样缓冲溶液洗涤2次后将细胞悬液滴在载玻片上，用2g/mL的DAPI避光染色15min，荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。

2.5 统计学方法所有数据用3次独立实验的平均值表示，应用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用（±s）表示，计数资料采用χ2检验，计量资料组间比较采用方差分析。组间两两比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 不同浓度猫人参醇提取物作用不同时间对肿瘤细胞生存率的影响见表1。100、200mg/mL猫人参醇提取物作用12、24、48h后，肿瘤细胞SGC-7901存活率明显低于PBS对照组（P＜0.05），50mg/mL猫人参醇提取物降低肿瘤细胞存活率的效果不明显，提示猫人参醇提取物对SGC-7901存在浓度—效应关系。随着作用时间的延长，猫人参醇提取物对肿瘤细胞SGC-7901增殖的抑制作用越强。

表1 猫人参醇提取物对肿瘤细胞SGC-7901存活率的影响%

3.2 猫人参醇提取物对肿瘤细胞形态学的影响由图1可见，对照组细胞生长旺盛，贴壁情况较好，处于正常对数生长阶段；而经过100mg/mL猫人参醇提取物处理24h后细胞形态发生了较大变化，贴壁疏松，密度变低，细胞变扁长，形状不规则。由图2可见，经DAPI染色后，100mg/mL猫人参醇提取物处理24h后肿瘤细胞核边缘残缺，染色质聚集，并伴有细胞核固缩或断裂现象及出现凋亡小体，为细胞凋亡的典型特征；对照组细胞的细胞核近似椭圆形，边缘较清晰，染色均匀。

图1 各组SGC-7901细胞（×100）

图2 DAPI荧光染色后各组SGC-7901细胞形态（×200）

4 讨论

中医药对于肿瘤的治疗有其独特的优势，如减轻放化疗毒副反应、治疗并发症等。猫人参作为民间及民族常用中药，文献报道其有一定的抗肿瘤作用［7］。浙江大学对猫人参有效成分研究发现，其中富含人体所需的各种无机元素，根茎部位含有丰富的氨基酸，特别是一些具有特殊生理活性的氨基酸含量较高，猫人参乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分得24-三羟基-12烯-齐墩果烷、积雪草酸、儿茶素、isotachioside、表儿茶素、熊果酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇等有效成分。文献报道从猫人参中提取的单体化合物科罗索酸（CRA）在体外对人结肠癌细胞HCT-8、K-562白血病细胞、人宫颈腺癌Hela细胞、人胃癌细胞SNU-601等具有明显抑制作用，能诱导细胞周期阻滞，导致细胞凋亡［8-9］。

本研究采用人胃癌SGC-7901细胞为实验细胞株进行体外实验，观察了猫人参醇提取物对其增殖的抑制作用以及对其形态学的改变。结果显示，猫人参醇提取物对SGC-7901细胞的增殖有较明显的抑制作用，且作用程度与浓度、作用时间相关。DAPI荧光检测到SGC-7901细胞在猫人参醇提取物的作用下，形态学发生明显变化，出现细胞凋亡的典型特征。下一步拟从细胞凋亡角度进一步阐明胃癌中医理论本质，揭示猫人参醇提取物对胃癌的作用机制及有效靶点。

［1］王霞，魏睦新，刘皓，等.猫人参提取物对亚硝基胍诱发的胃癌发生的预防作用.时珍国医国药，2014，25（11）：2649

［2］Shi Y，Zhou Y.The rele of surgery in the treatment of gastric cancer.J Surg Oncol，2010，101（8）：678

［3］浙江省食品药品监督管理局.浙江省中药炮制规范.杭州：浙江科学技术出版社，2006：99

［4］陈豪，潘坤官，何丽君.抗癌中药猫人参研究概况.海峡药学，2011，23（12）：9

［5］张亚妮，姜远英.猫人参抗肿瘤有效部位的筛选及相关实验研究.上海：第二军医大学，2005

［6］张玲艳，高翔，王晓玲.荭草的体外抗肿瘤活性研究.中国民族民间医药，2015（8）：33

［7］曲刚，李天文，崔洪斌，等.植物甾醇抑制SGC-7901胃癌细胞生长和诱导DNA损伤的研究.黑龙江八一农星大学学报，2008，20（1）：66

［8］AhmKs，HahmMS，ParkEJ，etal.Corosolicacid isolatedfromthefruitofCrataeguspinnatifidavar. psilosa is a protein kinase C inhibitor as well as a cytotoxic agent.Planta Med，1988，64（50）：468

［9］Xu Ye，Ge RL，Du J，et al.Corosolic acid induces apoptosis through mitochondrial pathway and caspases activation in human cervix adenocarcinoma HeLa cells.Cancer Lett，2009，284（4）：229

R282.710.5

A

1672-397X（2015）10-0077-03

曾志（1989—），女，硕士研究生，中医内科学专业中西医结合消化方向。

魏睦新，医学博士，教授，主任医师，博士研究生导师。weimuxin@njmu.edu.cn

2015-07-01

编辑：吴宁

江苏省中医药局资助项目（YB2015163，LZ13247）