麻杏石甘汤对肺炎支原体诱导巨噬细胞凋亡的保护作用

龙燕 王叶芳

（1.中国药科大学药理教研室，江苏南京 210009；2.南京市中西医结合医院儿科，江苏南京 210014）

麻杏石甘汤对肺炎支原体诱导巨噬细胞凋亡的保护作用

龙燕1王叶芳2

（1.中国药科大学药理教研室，江苏南京 210009；2.南京市中西医结合医院儿科，江苏南京 210014）

目的：观察麻杏石甘汤对肺炎支原体（MP）诱导巨噬细胞凋亡的保护作用。方法：培养巨噬细胞RAW246.7，分别将麻杏石甘汤1、5、10、20μL与巨噬细胞共孵育，模型组与空白对照组分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）20μL与细胞共孵育。除空白对照组，72h后利用灭活MP感染其余各组细胞24h。通过MTT检测各组细胞活力，LDH检测细胞损伤率，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：与空白对照组比较，模型组细胞活力显著降低（P＜0.05），LDH释放、细胞凋亡百分比显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤10μL与20μL组细胞活力显著提高（P＜0.05），LDH释放、细胞凋亡百分比显著降低（P＜0.05）。结论：麻杏石甘汤能对抗MP引起的RAW246.7细胞活力下降，抑制MP诱导的RAW246.7细胞凋亡，对细胞具有明显的保护作用。

麻杏石甘汤 巨噬细胞 细胞凋亡 细胞活力 体外实验

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是儿童呼吸道感染较常见的病原体，其发病率在婴幼儿中有逐年升高的趋势。麻杏石甘汤是辨证治疗痰热闭肺型肺炎支原体肺炎（mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）的常用方剂，经临床验证疗效确切［1］。课题组前期的研究也发现，麻杏石甘汤可降低MP感染后巨噬细胞内TNF-α蛋白水平的表达［2］。本研究通过体外培养巨噬细胞RAW246.7细胞株，给予麻杏石甘汤预孵育后感染灭活MP，观察细胞活力及细胞凋亡水平的变化，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 药品、菌株与试剂MP菌株29342（ATCC，M129-B7）。麻杏石甘汤，药物组成：麻黄、杏仁、石膏、甘草（1∶3∶6∶2），内含生药0.36g/mL，由南京市中西医结合医院药剂科提供。DMEM高糖培养基（Gibcol，USA）；胎牛血清（Gibcol，USA）；3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，sigma-Aldrich，USA）；二甲基亚砜（DMSO，Gibcol，USA）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（南京建成生物制品有限公司）；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒（thermo，USA）。

1.2 仪器DG3033A型酶联免疫仪（华东电子管厂）；XSZ-D倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）；BB-16型二氧化碳培养箱（Heraeus），XIDP超净工作台（苏州吴县实验动物仪器厂）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD）。

2 实验方法

2.1 MP菌株培养MP菌株培养于支原体肉汤培养基中。解冻培养基至溶液变黄时进行MP菌落培养，约12d形成荷包蛋样菌落，随机挑取一个菌落加入支原体肉汤后，37℃5%CO2，800r/min×72h培养，收集菌液，调整浓度至106～107CFU/mL。

2.2 巨噬细胞RAW246.7培养及分组DMEM培养基培养RAW246.7细胞株，待细胞密度达到60%后，将细胞接种于96与24孔板内，并分为以下组别：空白对照组，加入20μL磷酸盐缓冲液（PBS）；模型组，给予20μL PBS，72h后加入灭活MP（灭活条件：将MP菌株暴露于紫外线中2h）10μL；麻杏石甘汤各剂量给药组，分别以麻杏石甘汤1、5、10、20μL与细胞共孵育72h后，给予灭活MP菌株。

2.3 检测指标培养24h后，各组采用MTT检测细胞活力，LDH试剂盒检测LDH水平，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

2.3.1 细胞活力测定（MTT法）MTT可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶并沉积在细胞体内，但是死亡细胞内的MTT不能被还原。DMSO可以溶解这些紫色结晶，通过测定570nm波长下吸光度不同，可以检测细胞活力。配制MTT至终浓度为5mg/mL工作液。向96孔板每孔加入50μL MTT工作液。待反应4h后，吸去上清液（注意避免吸走甲瓒结晶），每孔加入200μL的DMSO，待孔内颗粒完全溶解后，以DMSO调零，测定570nm处的光密度值（OD），以空白对照组的OD值为100%，计算各给药组RAW246.7细胞活力。

2.3.2 LDH活性测定及抑制率计算收集24孔板内每孔培养液0.5mL，按照乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒使用说明书的步骤，测定细胞培养液的LDH活性，再根据下式计算各组LDH抑制率。

LDH抑制率=（模型组LDH含量-给药组LDH含量）/（模型组LDH含量-空白对照组LDH含量）

2.3.3 Annexin V与PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率根据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书，PBS洗涤细胞后，用双蒸水1∶4稀释结合缓冲液，以稀释的结合缓冲液重悬细胞，并调细胞密度为2×105个/mL，取195μL细胞悬液，加5μL Annexin V-FITC和10μL PI混匀，室温避光反应30min，上机检测。

2.4 统计学方法使用Stata（Version 10.0，Stata-Corp，LP）软件进行统计分析，所有数据用（±s）表示，采用的分析方法为单因素方差分析及两两比较（Scheffe test），P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

结果表明，MP感染RAW246.7细胞后，与空白对照组相比，模型组的细胞活力显著下降，细胞外LDH释放显著上升，细胞凋亡率显著增高；与模型组相比，麻杏石甘汤10μL与20μL组细胞活力显著上升，细胞外LDH释放显著下降，细胞凋亡率显著降低。见表1、图1。

表1 各组细胞活力、细胞外LDH含量及LDH抑制率、细胞凋亡率比较

图1 细胞凋亡检测图谱

4 讨论

支原体肺炎发病机制目前尚不明确，现认为感染后MP与机体免疫系统相互作用，导致多克隆促进T细胞与B细胞增殖，激活巨噬细胞、NK细胞与细胞毒T细胞的溶细胞活力，刺激淋巴细胞、巨噬细胞及单核细胞产生细胞因子，造成组织损伤［3］。有文献报道，呼吸道MP感染患者血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平明显增高［4］。TNF-α主要由巨噬细胞产生，可明显促进白介素8（IL-8）含量升高，而IL-8可趋化白细胞至炎症部位，加重组织损伤；亦可通过T细胞、B细胞调节机体的特异性及非特异性免疫功能，诱导中心粒细胞的趋化作用和局部浸润，损伤内皮细胞，降低细胞跨膜电位，诱发其他炎性介质释放；高水平TNF-α可促进B细胞合成过多的IgE，使机体出现高敏状态和I型变态反应［5-8］。亦有研究发现，MP可诱导巨噬细胞凋亡［9］。

本实验发现，MP可诱导巨噬细胞发生凋亡，细胞活力显著下降，细胞外LDH活力显著上升。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，主要存在于细胞内，属胞浆酶，细胞破裂时LDH释放到基质中，测定LDH活性可以推断细胞损伤程度。不同体积的麻杏石甘汤预处理细胞后，10μL及20μL麻杏石甘汤可显著降低由MP诱导的巨噬细胞凋亡率，提高细胞活力并同时降低细胞外LDH活力，但麻杏石甘汤1μL及5μL未显示出对细胞的保护作用，这可能由于麻杏石甘汤有效浓度过低所致。上述结果提示，MP可诱导巨噬细胞发生凋亡，麻杏石甘汤则对巨噬细胞具有保护作用。吞噬清除损伤细胞是巨噬细胞的重要生理功能，同时巨噬细胞可释放大量TNF-α参与调节机体细胞免疫。因此，当机体感染MP后，在疾病的后期由于大量巨噬细胞发生凋亡，细胞内大量TNF-α被释放至细胞外，炎症加重。而麻杏石甘汤通过抑制MP诱导的巨噬细胞凋亡，提高巨噬细胞活力，是其能够有效辅助治疗MP的主要机制之一。同时，本实验结果提示，麻杏石甘汤的有效浓度与其对巨噬细胞的保护作用有相关性，但是否在辅助治疗MP感染时，麻杏石甘汤浓度越高其疗效就越好仍需进一步验证。并且，麻杏石甘汤通过何种机制调节巨噬细胞凋亡仍需深入研究。

综上所述，本实验为麻杏石甘汤通过调节机体免疫达到辅助治疗MP提供了有力证据，且由于其对巨噬细胞具有保护作用，可推测麻杏石甘汤在其他炎症疾病中也可能发挥有效治疗作用。

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编辑：吴宁

R289.51

A

1672-397X（2015）10-0074-03

龙燕（1978—），女，博士，讲师，主要研究方向：药理学及神经生物学。

王叶芳，本科学历，副主任医师。wangyefang@126.com

2015-07-01