深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究

李丽珍，杨 键，田新朋，麦志茂，苏宏飞，龙丽娟，张 偲

（1.中国科学院 南海海洋研究所 热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东省海洋药物重点实验室，广东 广州 510301；2.中国科学院大学，北京 100049）

深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究

李丽珍1，2，杨 键1，田新朋1，麦志茂1，2，苏宏飞1，2，龙丽娟1，2，张 偲1，2

（1.中国科学院 南海海洋研究所 热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东省海洋药物重点实验室，广东 广州 510301；2.中国科学院大学，北京 100049）

从深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组中扩增到1条含淀粉结合域的水解糖苷13家族基因amy032，该基因编码氨基酸与已知蛋白一致性最高为67%。将amy032插入表达载体pET32a启动子下游，构建重组载体pET-amy。重组质粒导入大肠杆菌Rosseta（DE3）菌株中，SDS-PAGE分析结果显示目的基因成功实现异源表达。Ni-NTA对重组酶进行纯化，并对其酶学性质进行表征。结果表明：重组淀粉酶AMY032的最适作用温度为50℃，最适 pH为8.0，以可溶性淀粉为底物时的比酶活为（276±57）U/mg，Km为0.02g/L，Vmax为 70mg/（L·min）。Ca2+能提高该酶的催化活性，Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+对该酶有抑制作用。AMY032对生玉米淀粉和生大米淀粉具有水解活性，其比酶活分别为（49±12）U/mg和（39±11）U/mg；扫描电镜结果显示AMY032使生玉米淀粉的表面产生明显凹陷。

深海放线菌；基因组挖掘；有机物降解；淀粉结合域；克隆表达

生淀粉是一种结构复杂而致密的有机大分子颗粒，其外层有水化层包裹，一般淀粉酶难以进入生淀粉内部对其进行水解，所以生淀粉的糖化往往需要通过高温蒸煮来破坏生淀粉颗粒的水化层结构［1］。生淀粉酶对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒表现出强水解活性［2］，可将传统的淀粉糊化、液化、糖化工艺合并为一步直接糖化［3］。若将生淀粉酶应用于无蒸煮的酒精发酵，总耗能可节约30%～40%［4］，因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度关注。

具有生淀粉降解活性的酶通常具有3个结构域［5］：催化域（catalytic domain，CD）、淀粉结合域（starch-binding domain，SBD）和一段连接区域。淀粉结合域（SBD）对于生淀粉的酶解至关重要，一方面它使酶吸附到淀粉颗粒上从而有利于酶的水解作用，另一方面它本身就会破坏淀粉颗粒的结构从而促进酶解［6］。有研究发现，没有淀粉结合区域的葡萄糖淀粉酶对可溶性淀粉的水解速率不变，而对生淀粉颗粒的水解能力非常低［7］。目前为止，绝大多数生淀粉酶的来源是陆地微生物［8］，也有少量海洋细菌的α-淀粉酶被报道具有生淀粉降解活性，分别来自Bacillus sp.ALSHL3［9］和Bacillus aquimaris MKSC 6.2［10］。

以海洋动植物的有机体为主的大分子有机物（包括碳水化合物、蛋白质和脂类）源源不断地向沉积物中沉降，为沉积物中的异养微生物提供了充足的营养来源。出于摄食的需求，这些微生物往往首先要分泌出一系列水解酶类将颗粒有机物水解为可吸收的小分子物质。因而海洋沉积环境来源的微生物具有生产高活性有机物水解酶的潜力。

笔者从1株深海放线菌Streptomyces sp.SCSIO 03032的全基因组序列中挖掘出1条具有CBM20家族淀粉结合域的新型α-淀粉酶基因amy032，其编码的蛋白具有潜在水解生淀粉的能力，将该基因进行异源表达，并表征其酶学特性，以期为其工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

海洋放线菌Streptomyces sp.SCSIO 03032（分离于3 412 m深的印度洋沉积物）、Escherichia coli Rosseta（DE3）、Escherichia coli DH5α，保藏于热带海洋生物资源与生态重点实验室；表达载体pET32a，Novagen公司；LA taq酶、pMD18-T载体、限制性内切酶，TaKaRa公司；胶回收试剂盒，OMEGA公司。3，5-二硝基水杨酸（DNS）等化学试剂均为市售分析纯。

1.2 Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组 DNA的提取

有关DNA的提取方法参照文献［11］进行。

1.3 α-淀粉酶基因amy032的克隆

Streptomyces sp.SCSIO 03032的淀粉酶基因序列已经通过基因组测序获得，使用生物信息学软件Vector NTI进行引物设计，获得上游引物5′-ATATGGATCCCTCACCGTCGCCGCCCCCGCCGCCCAGG-3′和下游引物5′-ATATCTCGAGGGTGCGCCAGACGTCGCTCAGGCTG-3′。使用所设计的上下游引物，以Streptomyces sp.SCSIO 03032基因组DNA为模板PCR扩增α-淀粉酶基因amy032，用限制性内切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切 α-淀粉酶基因amy032后，与经BamHⅠ和XhoⅠ酶切的表达载体pET32a进行连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布到含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选克隆。进一步提取质粒DNA，双酶切验证正确后命名重组质粒为pET-amy。

1.4 重组菌株的培养和诱导

将重组质粒pET-amy转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中，接种至50mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD600为0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L，28℃诱导10 h。9 000r/min离心10min，收集菌体，用10mL浓度为100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破胞10min。12 000r/min的转速离心10min，上清即为AMY032的粗酶液。

1.5 α-淀粉酶的分离纯化

粗酶液过镍柱，用pH为8.0的5 mmol/L的咪唑溶液平衡柱子，加入酶液后再用5 mmol/L和20 mmol/L的咪唑溶液洗掉杂蛋白，最后用 500 mmol/L的咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集到的洗脱液为纯化后的酶液，用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。

1.6 α-淀粉酶AMY032酶活的测定

取50 μL稀释一定倍数的纯化重组酶AMY032，加入到450 μL 0.01g/L的淀粉溶液（Tris-HCl pH8.0）中，50℃水浴10min后，加入500 μLDNS溶液。沸水中反应5min，室温冷却，分光光度计测量在545 nm下的吸光值。吸光值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图做比较计算酶活。一个酶活力单位（U）定义为在上述反应条件下，每分钟转化等价于1 μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量。

1.7 酶学性质研究

1.7.1 温度对酶活性的影响

在反应温度分别为20、30、40、50、60和70℃的条件下，测定不同温度条件下的酶活。以酶活最高为100%，其余为相对酶活，确定酶的最适反应温度。每组设置3个重复试验。

1.7.2 pH对酶活性的影响

用pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和11.0的缓冲液配制不同pH的0.01g/L可溶性淀粉溶液，测定相应的酶活力。以酶活最高为100%，其余为相对酶活，确定酶的最适反应pH。每组设置3个重复试验。

1.7.3 金属离子对酶活性的影响

以不加金属离子为对照，分别在酶液中加入5 mmol/L的 Ca2+、Na+、Ni2+、Ba2+、Mg2+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+处理，再加入1%质量分数的可溶性淀粉反应，测定酶活。每组设置3个重复试验。

1.7.4 降解生淀粉能力的比较

取50 μL稀释一定倍数的纯化重组酶AMY032，分别与0.01g/L生玉米淀粉、生大米粉、生红薯粉和生木薯粉混合后，于50℃摇床、100r/min反应20min，测定上清液中还原糖的量，计算酶的比酶活，并与可溶性淀粉对比。每组设置3个重复试验。

1.8 扫描电镜表征

0.01g/L的生淀粉添加50 U的AMY032降解30min后，离心，沉淀后用无水乙醇洗涤3次，自然风干。使用 Ion Sputter E 1010型离子溅射仪（Hitachi公司）在5.0 kV和20 mA的条件下对淀粉颗粒喷40 s，使颗粒表面镀Pt。采用Hitachi S 4800型扫描电镜（Hitachi公司）观察和拍照。

2 结果与讨论

2.1 α-淀粉酶基因amy032的核苷酸序列分析以及编码产物AMY032的氨基酸序列分析

用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上的软件如ORF Finder、BLAST对α-淀粉酶DNA序列进行分析发现，α-淀粉酶基因amy032的开放阅读框由1 737个脱氧核苷酸组成。其中起始密码子为GTG，终止密码子为TGA，测序结果提交GenBank，基因登录号为KJ577548。α-淀粉酶基因amy032编码1个含579个氨基酸的蛋白质。使用BLAST搜索GenBank数据库，与AMY032催化功能域相似性最高的为灰黄链霉菌（Streptomyces flavogriseus）的假定水解糖苷酶蛋白，其氨基酸一致性为67%（图1）。用组件结构研究工具Pfam分析来源于海洋放线菌 Streptomyces sp.SCSIO 03032的 α-淀粉酶AMY032的组件结构，结果显示：自N端的1～39位氨基酸为信号肽，自N端的71～345位氨基酸为家族13水解糖苷酶的催化功能域，自N端第397～467位氨基酸为α-淀粉酶的C端β折叠域，自N端483～569位氨基酸为CBM20淀粉结合功能域。淀粉结合域在真菌生淀粉酶中非常常见，大多数真菌生淀粉酶的淀粉结合域都位于羧基端，但是米根霉的糖化酶的SBD是位于氨基端。真菌来源的糖化酶的SBD包括了大约100个氨基酸残基，这个区域可能处于催化区域的后面，也可能是处在一个糖基化连接区域的后面。

2.2 α-淀粉酶基因amy032在大肠杆菌中的表达及重组酶的纯化

笔者前期尝试使用pET28a和pET22b对基因amy032进行表达，表达产物均以无活性的包涵体形式存在，pET32a表达载体在多克隆位点的上游添加315 bp的Trx标签用于辅助蛋白折叠。重组质粒pET-amy导入大肠杆菌后，重组细胞裂解液表现出淀粉酶活性。SDS-PAGE电泳结果表明α-淀粉酶基因amy032在Escherichia coli Rosseta（DE3）中得到表达，在约7.5×104附近出现了明显条带，与预测的蛋白大小相符（包括Trx标签1.0×104在内）。粗酶液经镍柱亲和层析纯化后得到单一的电泳条带（图2），纯度达95%以上，可用于酶学性质分析。

图2 重组菌株表达α-淀粉酶的SDS-PAGE分析结果Fig.2 SDS-PAGE analysis of amy032 expression in E.coli

2.3 酶学性质研究结果

考察温度对AMY032酶活力的影响，结果见图3。由图3可知：温度为50℃时，酶活力最大。当温度大于50℃时，酶活力下降较快。温度达到70℃时，该酶仅存有20%酶活力。由此可知，该酶的最适反应温度为50℃。

图3 反应温度对AMY032酶活的影响Fig.3 Effects of temperature on activity of AMY032

考察pH对AMY032酶活力影响，结果见图4。由图4可知：当pH为8.0时，酶活力最高；当pH大于10.0时，酶活力仅有17%。由此可发现，该酶反应的最适pH为8.0。

考察金属离子对AMY032酶活力的影响，结果见表1。由表1可知：Ca2+对生淀粉酶有促进作用，Ni2+、Cu2+、Zn2+和 Mn2+对该酶有抑制作用，用金属离子Ni2+处理酶液后，相对酶活只剩18%；Cu2+处理酶液后，相对酶活为34%；Zn2+处理酶液后，相对酶活仅剩 14%；Mn2+处理酶液后，酶活为24%。

图4 pH对AMY032酶活的影响Fig.4 Effects of pH on the activity of AMY032

表1 金属离子对AMY032酶活的影响Table 1 Effects of metal ions on enzyme activity of AMY032

以可溶性淀粉为底物，在pH8.0、温度50℃的条件下取不同质量浓度（ρS）的可溶性淀粉，测得反应速率（V），得到1/V与1/ρS的关系，结果见图5。由图5双倒数线结果计算重组淀粉酶AMY032对可溶性淀粉的Km值为0.02g/L，最大反应速率（Vmax）为70.18mg/（L·min）。

图5 淀粉酶AMY032 Km值的测定Fig.5 Linewear-Burk plots of AMY032

2.4 AMY032对生淀粉的水解

以不同的生淀粉为底物，测定AMY032对不同生淀粉的降解能力，结果见表2。由表2可知：生玉米淀粉和生大米粉对酶解作用敏感，其比酶活分别是（49±12）和（39±11）U/mg，但与陆地来源的生淀粉酶比较，AMY032对生淀粉的水解率还需要提高而与海洋来源的生淀粉酶 AmyP［17］（39.6±1.4）U/mg相比，AMY032具有良好的水解生淀粉能力。而生红薯粉和生木薯粉对酶解作用不敏感。

表2 AMY032对不同生淀粉的降解活性Table 2 Degrading activities of AMY032 to various raw starch

图6 AMY032水解生淀粉的SEM照片Fig.6 SEM images of untreated and treated raw corn starch granules with AMY032 by scanning electron microscopy

使用扫描电镜观察了AMY032降解生淀粉前后淀粉颗粒的变化情况，以未加入生淀粉酶为对照组，结果见图6。由图6可知：在50℃反应20min后淀粉颗粒表面致密光滑（图6（a）），而反应组中经过重组淀粉酶AMY032处理后的生玉米淀粉颗粒表面出现许多细密的孔洞（图 6（b）），说明AMY032能有效破坏生玉米淀粉颗粒表面结构并释放还原糖。目前，很多来自陆地的具有生淀粉降解能力的α-淀粉酶被广泛的研究，庞宗文等［13］报道从土壤中分离到4株具有生淀粉分解酶活性的根霉，其中Rhiizous sp.2和Rhiizous sp.3的生淀粉分解酶活性最高，分别为每克干曲520 U和405 U。郭爱莲等［14］报道从自然界分离到1株高酶活的生淀粉糖化酶菌株黑曲霉Sx，在最适产酶条件下酶活达到382 U/g。丁立孝等［15］报道从23份土样中筛选出105株野生型霉菌，其中有10株具有较高的糖化生淀粉的能力。AMY032对不同生淀粉的降解能力存在差异，主要是因为不同植物来源的天然生淀粉对生淀粉酶的敏感性差异很大，淀粉颗粒的大小、表面特性和内部结构都成为影响因素［16］。一般来说，谷物来源的淀粉较其他来源的淀粉容易被降解［17］。

3 结论

克隆到来源于印度洋 Streptomyces sp.SCSIO 03032的α-淀粉酶基因，并检测到纯化的α-淀粉酶具有生淀粉的降解能力，测定最适温度为50℃，最适pH为8.0。AMY032对生玉米淀粉具有水解活性，其比酶活为（49±12）U/mg，AMY032的成熟肽中有非常重要的两部分，一是自N端的第71～345位氨基酸为家族13水解糖苷酶的催化功能域，二是自N端第483～569位氨基酸为CBM20淀粉结合功能域。

基于氨基酸相似性，CBM分成了42个家族，在CAZy的分类中，CBM中有六类是SBD家族，分别是CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41。笔者研究的生淀粉酶AMY032的羧基端含有约100个氨基酸的CBM20类淀粉结合域，这段淀粉结合域很可能对AMY032水解生淀粉的能力有重要贡献，因而有必要对羧基端的氨基酸功能进行深入研究。

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（责任编辑 荀志金）

Cloning，expression and characterization of raw amylase gene fromdeep-sea actinomycete

LI Lizhen1，2，YANG Jian1，TIAN Xinpeng1，MAI Zhimao1，2，SUN Hongfei1，2，LONG Lijuan1，2，ZHANG Si1，2
（1.Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica，CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

The glycoside hydrolase family 13 gene amy032，deduced amino acid sequence of which exhibited highest identity of 67%with known protein in GenBank，was amplified from a deep sea strain Streptomyces sp.SCSIO 03032.The mature gene was inserted into pET32a under T7 promoter. Recombinant vector was transformed in Escherichia coli Rosetta（DE3）cells，and SDS-PAGE analysis results showed that the amylase gene was successfully expressed.Enzyme AMY032 was then purified by nickel-affinity chromatography and characterized.The optimum temperature of the purified enzyme was 50℃，and optimum pH 8.0.With soluble starch as substrate，specific activity was（276±57）U/mg，Kmwas 0.02g/L and Vmaxwas 70mg/（L·min）.The catalytic activity of the enzyme was slightly improved by Ca2+and restrained by Ni2+，Cu2+，Zn2+and Mn2+.AMY032 could hydrolyze raw corn starch and raw rice starch，with specific activity of（49±12）U/mg and（39±11）U/mg，respectively.Scanning electron microscope showed AMY032 generate obviously dents on raw corn starch surface.

deep-sea actinomycete；genome mining；organic matter degradation；starch-binding domain；cloning and expression

Q93；TQ925.1

A

1672-3678（2015）02-0035-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.007

2014-04-02

国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA092104）；国家自然科学基金重点项目（41230962）；国家海洋公益专项（201305018）；广东海洋经济创新发展区域示范项目（GD2012-D01-002）；中国科学院重点部署项目（KSCX2-EW-B-13）

李丽珍（1989—），女，广东汕头人，硕士研究生，研究方向：海洋生物学；张偲（联系人），研究员，E-mail：zhsimd@scsio.ac.cn