通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响

王 成，郑志永，朱 莉，高敏杰，詹晓北

（1.江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏 无锡 214125）

通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响

王 成1，2，郑志永1，2，朱 莉3，高敏杰1，2，詹晓北1，2

（1.江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏 无锡 214125）

高山被孢霉具有很强的积累花生四烯酸（ARA）的能力，通过对30 L气升式反应器发酵过程的通气量进行调控，结果发现：通气量对高山被孢霉菌体生长、形态及ARA合成具有显著影响。中等大小的球形菌丝形态有利于菌体持续生长和油脂积累，ARA占总油脂的含量最高，而羽状菌丝形态菌体中总油脂含量和ARA含量均小于球形菌丝形态菌体中的含量。通气量为1.0 vvm（1 vvm为每分钟通气量与罐体实际料液体积之比）时有利于菌体保持良好形态和生长，通气量为1.4 vvm有利于发酵对数期后（72～168 h）ARA的积累。提出一种两阶段通气量控制策略，在气升式发酵罐中高山被孢霉的菌丝形态得到显著改善，ARA产量达到4.72 g/L，比对照提高了40.1%。

高山被孢霉；花生四烯酸；气升式反应器；通气量

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），全称二十碳-5，8，11，14-四烯酸（全顺），是ω-6系列多不饱和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于机体各种组织的细胞膜上，具有多种生理活性，被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。ARA是人体中前列腺素、血栓素和白三烯等重要物质的前体物质，对预防心血管疾病具有很好功效［1-2］，并且ARA可以作为食品添加剂和营养强化剂添加到婴儿奶粉中，有助于提高婴幼儿感光及认知能力［3］。

ARA在成年人体内合成量很少，在婴幼儿体内，因缺少相应的酶而无法合成［4］。传统ARA主要来源于蛋黄、动物肝脏和肾上腺等，但动物组织中ARA含量大多低于5%［5］，并且提取得到的为ARA粗品，含有大量的二十碳五烯酸，而过量的二十碳五烯酸会抑制ARA的吸收和合成，从而降低细胞中ARA水平，导致婴幼儿大脑发育不成熟，甚至性早熟［6］。利用微生物发酵生产ARA具有突出的优势：其不受原材料及气候限制、生产周期短、培养工艺简单并且含量高。因此，微生物发酵生产ARA已成为主流趋势。高山被孢霉（Mortierella alpina）目前被认为是发酵生产ARA的最佳菌株，其菌体中ARA含量丰富且不饱和脂肪酸组成合理［7-8］。

气升式反应器具有结构简单、剪切应力小、能量耗散均匀和供气效率高等优点，对剪切力敏感的微生物培养具有重要意义［9］，用于ARA发酵有利于保持M.alpina菌体的优势形态，而菌体形态对总油脂及ARA的积累影响很大［10］。目前利用气升式反应器发酵生产ARA的文章鲜有报道，本文中笔者将考察气升式反应器重要操作参数——通气量对M.alpina的生长及合成 ARA的影响，以期提高ARA的发酵水平。

1 材料与方法

1.1 菌株

高山被孢霉 （Mortierella alpina）CFCC 88447，购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 培养基

斜面培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20；pH自然。

种子培养基（g/L）：葡萄糖30，豆粕粉10，酵母膏 10，KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0。

发酵培养基（g/L）：初始葡萄糖50，豆粕粉10， KH2PO43，NaNO33，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0。

1.3 培养条件

种子液的制备：500 mL三角瓶中加入100 mL种子培养基，将M.alpina菌种接种到种子培养基中，25℃、110 r/min振荡摇床培养48 h作为种子液备用。

气升式反应器恒速补料分批发酵条件：30 L气升发酵罐（无锡市海信化机设备有限公司），接种量10%，装液系数为0.6，通气量0.8 vvm（1个vvm表示每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值），分批发酵时初始pH为6.0，使用2.0 mol/L NaOH维持发酵液pH为6.0±0.1，发酵温度为25℃，发酵开始后，恒速 （6.12 mL/h）流加补料液 （700 g/L葡萄糖）直至发酵7 d结束。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量测定

准确量取50 mL发酵液进行真空过滤（直径7 cm中速定量滤纸），用蒸馏水冲洗至流出液无色，将菌体置于培养皿中，105℃下烘干至恒质量，称菌体干质量。生物量计算公式：生物量=菌体干质量/发酵液体积。

1.4.2 菌球直径的测定

发酵结束后，取2 mL摇匀后的发酵液倒入培养皿中，加入20 mL去离子水，稀释后从中随机选取30个菌球，以游标卡尺为参照逐个测定菌球直径，计算平均值和标准差。

1.4.3 葡萄糖含量测定

利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法［11］测定发酵液中残留的葡萄糖含量。

1.4.4 总油脂含量测定［12］

精确称取干燥后的菌体0.5 g，置于研钵中充分研磨至粉状，转移到7 mL离心管中，加入3 mL CHCl3-CH3OH溶液（体积比1∶2），剧烈振荡抽提1 min，再加入1 mL CHCl3溶液，再次剧烈振荡 1 min，最后加入1 mL去离子水，振荡萃取1 min，静置30 min后溶液分层，将下层有机相全部取出至预先称质量的5 mL离心管中，水浴（80℃、4 h），将有机相蒸干，干燥后再次称离心管质量，减去空离心管的质量即为总油脂的质量。

1.4.5 ARA含量测定［13］

精确称取1.4.4中总油脂0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液，60℃水浴加热至油脂完全溶解，冷却后加入2 mL体积分数25%的BF3-C H3OH溶液，60℃水浴酯化20 min，再次冷却后加入2 mL正己烷并振荡混匀，最后加入2 mL NaCl饱和溶液并振荡，静置30 min后取上层有机相于1个干燥试管中，并加入少量无水Na2SO4以去除微量水分，供气相色谱/质谱（GC/MS）分析使用。

GC/MS分析采用美国瓦里安公司气相色谱串联质谱联用仪1200 L型GC-MS；色谱条件：色谱柱为DB-225，30 m×0.25 mm×0.15 μm毛细管柱；载气为He；流量为1 mL/min，不分流进样；程序升温条件：初始温度180℃，维持2 min，以5℃/min速率升温至230℃，维持12 min；质谱条件：接口温度250℃；离子源温度200℃；离子化方式EI；电子能量70 eV；检测电压350 V；发射电流200 μA。

按照上述分析方法得到样品气相图谱如图1所示，其不同保留时间所对应的油脂组分见表1。

图1 M.alpina产油脂的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of lipids produced by M.Alpina

表1 M.alpina合成的油脂组分分析Table 1 Components of lipids produced by M.alpina

2 结果与讨论

2.1 通气量对M.alpina菌体生长影响

气升式反应器中通气量大小对丝状真菌M.alpina菌体形态及生长影响较大，通气量较大时相应的剪切力也会增加，可能影响菌体形态；通气量较小时供氧不足，亦影响菌体生长。为此，首先考察不同通气量大小对M.alpina菌体形态及生长的影响。

图2 通气量对M.alpina菌体生长的影响Fig.2 Effects of aeration ratio on cell growth of M.alpina

在不同通气量（0.6、1.0、1.4和1.8 vvm）时30 L气升式反应器恒速补料分批发酵，结果如图2、图3和表2所示。从图2可以看出：发酵起始后菌体快速进入对数生长期，72 h后菌体生长放缓，进入稳定期。结合图3和表2可以看出：不同通气量对发酵过程菌体形态有显著影响，通气量较低时（0.6 vvm），发酵液中菌球（图3（e））平均直径最大（3.9 mm），球状菌体所占比例也最高（88.4%）；而随着通气量的增加，气泡逸出液面的几率增加，气泡破碎产生的剪切力趋于明显，发酵液中球状菌体比例趋减，不规则羽状形态菌体（图3（f））比例不断增加，同时菌球平均直径减小，发酵液逐渐变得黏稠。比较不同通气量水平可看出：通气量1.0 vvm时，M.alpina生物量最高，此时羽状菌体比例低于通气量1.8 vvm时的比例，菌球（图3（g））平均直径相对于0.6 vvm通气量时较小（2.4 mm），而菌体生物量和细胞得率系数均达到最大，分别为34.6 g/L和0.489 g/g，同时最大比生长速率μmax（0.055 h-1）比其他通气量时要高，且达到最大值的时间（12 h）要稍短。可见，利用M.alpina进行气升式反应器发酵生产ARA时，通气量的选择很关键。

在气升式反应器中，通气量直接影响反应器内的体积传氧系数kLa，进而影响反应器的传氧速率。当通气量较低时（0.6 vvm），气泡上升速率慢，剪切速率小，菌丝相互缠绕易形成大的菌球，菌球的形成有利于菌丝保持其完整形态而不发生断裂，使菌体维持正常的生理状态，但是Huang等［14］也发现，当菌球直径过大时，不利于O2从发酵液中扩散至菌球内部，会导致菌球内部的菌丝体因缺氧而死亡和自溶。而当通气量较大时（1.8 vvm），虽然溶氧能大幅提高，但随着气泡上升，速率加快，气泡在液面破裂时，细胞所受的剪切力也快速增加，菌丝缠绕形成的菌球又会随气泡破裂而崩散，形成大量羽状形态的菌体，导致发酵液变得黏稠，这亦会影响O2的传递［15］。而当通气量为1.0 vvm时，合适的通气量有利于形成大小合适的菌球形态，维持较小的发酵液黏度，一方面有利于保持大部分菌丝以菌球形态相互缠绕而不断裂，另一方面，较小的菌球也有利于O2的传质和生物量的积累，故通气量1.0 vvm时较有利于M.alpina菌体的生长。

图3 通气量对M.alpina菌体形态的影响Fig.3 Effects of aeration ratio on mycelia morphology of M.alpina

表2 通气量对M.alpina菌体生长的影响Table 2 Effects of aeration ratio on mycelia morphology by M.alpina

2.2 通气量对M.alpina菌体中总油脂和ARA合成影响

ARA是M.alpina胞内次级代谢产物，其最终产量的决定性因素有生物量、总油脂含量和ARA占总油脂比例。图4为通气量对M.alpina菌体中总油脂和ARA生物合成的影响结果。

图4 通气量对M.alpina菌体中总油脂和ARA生物合成影响Fig.4 Effects of aeration ratio on total lipid and ARA biosynthesis by M.alpina

从图4可以发现：总油脂的合成与菌体生长呈部分耦联关系，在0～72 h内随菌体生物量的快速增加而迅速积累，至96 h时，非油脂生物量基本达到稳定，此后菌体主要进行油脂的合成。从整个发酵过程看，不同通气量对菌体中总油脂的比例影响不大，最终总油脂产量主要依赖于菌体的生物量。同时由图2和图3可知，1.0 vvm通气量时最有利于M.alpina菌体维持良好形态和生长，发酵结束后生物量最高，所以此时总油脂含量也最高，达到15.2 g/L。但对比不同时期、不同通气量条件时的ARA合成情况却发现，在0～72 h阶段，1.0 vvm通气量时ARA平均合成速率最高（0.031 g/（L·h）），而在72～168 h阶段，通气量为1.4 vvm时，ARA平均合成速率最高（0.016 g/（L·h））。此外，分析总油脂中ARA比例变化规律同样可以看出，发酵72 h后，通气量1.4 vvm条件下，总油脂中ARA比例已明显高于其他通气量时比例。发酵结束时，1.4 vvm通气量对应总油脂中ARA比例和ARA产量最高，分别为29.1%和3.93 g/L，比1.0 vvm通气量时分别提高了31.6%和16.6%。以上分析表明：总油脂产量主要依赖于菌体生物量，当通气量1.0 vvm时最有利于菌体生长，此时油脂也含量最高。

表3为不同菌体形态M.alpina中总油脂和ARA的含量比较结果。从表3可以看出，不同菌体形态中总油脂含量存在很大差异，其中羽状菌体中油脂含量较低。分析原因可能是：通气量较大时，菌丝发生断裂，损伤较大，而这种损伤有时候是不可恢复的［16］，同时，损伤的菌体需要利用更多的底物进行自身修复［17］，从而影响了油脂合成。因此，适当提高通气量对菌体生长对数期后（72～168 h）ARA合成更有利，即溶氧在ARA合成中起着至关重要作用，这与Higashiyama等［18］发现溶氧可以提高产油微生物菌体胞内不饱和脂肪酸比例结果一致，其原因是不饱和脂肪酸的形成要经过脂肪酸链的延长和油脂脱饱和作用，而O2是脱饱和途径电子传递链的末端受体，并且O2还可调控脱饱和酶的形成。但结合图2和图3结果分析发现，M.alpina菌体生长和目标产物ARA合成的最适通气量大小不一致，因此，采用分阶段溶氧调控策略进行下一步实验。

表3 不同菌体形态M.alpina中总油脂和ARA的含量比较Table 3 Comparison of total lipid and ARA productions in different mycelia morphology of M.alpina

2.3 两阶段通气量控制策略对 M.alpina生产ARA的影响

为了最大程度同时满足M.alpina菌体生长和目标产物ARA合成需要，提高最终ARA产量，对发酵过程通气量进行了分阶段控制，即初始阶段（0～72 h）保持通气量1.0 vvm，对数期后 （72～168 h）保持通气量1.4 vvm，以1.0 vvm通气量为对照，结果如图5、图6和表4所示。在0～72 h阶段，M.alpina菌体处于对数生长期，此时通气量对应的剪切速率较小，有助于维持菌体成球状（图6），保证了氧传递效率，最终菌体能够更快生长，实现总油脂和ARA合成速率的提高。在72～168 h阶段，菌体生长变缓，非油脂生物量基本维持稳定，此后菌体生物量的增加主要来自油脂的合成，发酵结束时最终生物量为35.2 g/L，总油脂达到16.2 g/L，相比单一采用1.4和1.0 vvm通气量进行发酵均有了显著提高。同时，在72～168 h阶段因通气量由1.0 vvm提升至1.4 vvm，导致剪切速率相应增加，随着发酵的进行，菌球平均直径不断减小，并且羽状形态菌体比例有了一定增加（图6），但与图3（c）和图3（d）相比，菌体形态有了明显改善，发酵结束时羽状菌体比例降低。另一方面，溶氧的提高增强了菌体油脂中非饱和脂肪酸的转化能力，特别是ARA的合成，最终 ARA产量达到4.72 g/L，比对照（1.0 vvm）提高了40.1%。可见，通过两阶段通气量调控策略，在保证M.alpina良好生长的同时，实现ARA产量的显著增加。

图5 两阶段通气量调控策略对M.alpina生产ARA影响Fig.5 Effects of two-stage aeration ratio control strategy on ARA biosynthesis by M.apine

图6 两阶段通气量调控过程中M.alpina菌体形态变化Fig.6 The morphological changes of M.alpina in two-stage aeration ratio control strategy

表4 两阶段通气量调控策略对M.alpina生产ARA的影响Table 4 Effects of two-stage aeration ratio control on ARA biosynthesis by M.alpina

3 结论

在30 L气升式反应器水平上研究了不同通气量对M.alpina菌体生长和ARA合成影响。结果表明，通气量为1.0 vvm时有助于M.alpina菌体生长，通气量为1.4 vvm时有助于发酵对数期后（72～168 h）目标产物ARA的合成。通过两阶段通气量调控策略，最终ARA产量达到4.72 g/L，相比对照提高了40.1%，效果显著，体现了气升式反应器发酵生产ARA过程中通气量调控的重要性，同时为ARA的生产工艺研究提供了一种新的思路。

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（责任编辑 管 珺）

Effect of aeration ratio on production of arachidonic acid by Mortierella alpina in airlift reactor

WANG Cheng1，2，ZHENG Zhiyong1，2，ZHU Li3，GAO Minjie1，2，ZHAN Xiaobei1，2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

Mortierella alpina has strong ability to accumulate arachidonic acid（ARA）in the mycelium. When M.alpina fermentation was carried out in a 30 L airlift bioreactor，the aeration has significant impact on cell growth and ARA synthesis.Morphologcial analysis revealed that medium size pellet morphology was beneficial to the cell growth and ARA biosynthesis，while feathery mycelia morphology had negative effects on the production of total lipid and ARA.When the aeration was controlled at 1.0 vvm（gas volume flow per unit of liquid volume per minute）in the first stage，cells grew well and the morphology showed regular pellet mycelia.In the second stage，the aeration ratio was increased to 1.4 vvm for accumulation of ARA after logarithmic phase（72-168 h）.The two-stage aeration significantly improved mycelial morphology of M.alpina with the ARA yield of 4.72 g/L，which was 40.1%higher than the control.

Mortierella alpina；arachidonic acid；airlift bioreactor；aeration ratio

Q815

A

1672-3678（2015）01-0068-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.012

2014-01-26

国家自然科学基金（31171640）

王 成（1988—），男，江苏宿迁人，研究方向：轻工技术与工程；詹晓北（联系人），教授，E-mail：xbzhan@yahoo.com