子午流注针刺法对哮喘模型豚鼠气道重塑的干预作用*

蔡 彦 李楚天 林黄果 邱思婕

（广东省中医院，广东 广州510120）

子午流注针刺法对哮喘模型豚鼠气道重塑的干预作用*

蔡 彦 李楚天 林黄果 邱思婕

（广东省中医院，广东 广州510120）

目的 探讨纳子法对哮喘豚鼠模型气道重塑的针灸治疗效果，揭示子午流注纳子法针对哮喘气道重塑的机理，为临床运用子午流注治疗哮喘提供一定的实验依据。方法 将32只健康豚鼠分为A组于申时（15:00-17:00）进行电针，B组于巳时（9:00-11:00）进行电针，C组造模不治疗和D组（正常对照组），每组8只，并采用鸡卵白蛋白致敏法复制实验性过敏性哮喘模型，以此观察4组豚鼠的气道壁和气道平滑肌厚度及肺组织转化生长因子（TGF）-β1含量的变化情况。结果 A、B组与C组比较，肺内气管壁厚度、平滑肌厚度以及TGF-β1含量均明显降低（P＜0.01）；且A组比B组更能有效降低厚度及TGF-β1含量。结论 电针治疗能阻止哮喘气道重塑的发生发展，并且按时辰取穴的纳子针法申时治疗A组的哮喘气道重塑改善情况优于不按时辰治疗的巳时B组，提示按时辰针灸对哮喘疗效更佳。

纳子法 哮喘 气道重塑

支气管哮喘是常见、多发的变态反应性疾病，目前其发病率和死亡率呈现逐年上升态势。一般认为哮喘基本特征为气道慢性炎症、气道高反应性和气道重塑，气道重塑是难治性哮喘的重要发病机制，而转化生长因子（TGF）-β1是其中一个重要影响因素［1］。中医子午流注针法治疗哮喘有一定疗效，但涉及纳子法实验偏少。本研究探讨子午流注针法对哮喘模型气道壁和气道平滑肌厚度及肺组织TGF-β1的变化情况，揭示子午流注纳子法的治疗机理，为临床应用提供可靠的理论基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 普通级豚鼠属白化豚鼠32只 ［花东信华实验动物养殖场提供，动物许可证：SCXK（粤）2009-0023］，体质量300～400 g，雌雄各半。按照随机数字表法分为A、B、C、D 4组，每组8只。电针申时（15∶00-17∶00）组（A组）、电针巳时（9∶00-11∶00）组（B组）、模型不治疗组（C组）和正常对照组（D组），每组8只。

1.2 药物及设备 鸡卵白蛋白（美国sigma公司，生产批号：A5253供）；转化生长因子TGF-β1成套免疫组化试剂盒 （购自武汉博士德生物工程公司）；粤华WH2-2000型超声雾化仪 （广东粤华医疗器械厂有限公司）；EG1150H型石蜡包埋机（德国徕卡仪器公司）；ASP200S型生物组织脱水机 （德国徕卡仪器公司）；RM2245型石蜡切片机 （德国徕卡仪器公司）；5020型石蜡染色机 （德国徕卡仪器公司）；DK-600S水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；图像采集系统、采集软件（日本OLYMPUS公司）。

1.3 模型制备［2］在相同环境下先将动物饲养3d以适应环境后开始造模。第4日，除D组外，其余组均采用鸡卵白蛋白致敏，常规消毒后一次性腹腔注射10%鸡卵白蛋白生理盐水1mL，使豚鼠处于致敏状态。致敏后第7日将A、B、C组动物置特制激发箱内，以1%鸡卵清蛋白溶液喷雾激发，按个体差异每次激发2～10min，直至“哮喘”发作，表现为腹式呼吸明显，呼吸频率加快且节律不整、活动减少等症状。豚鼠连喷4d。D组以等量生理盐水1mL腹腔注入，7d后同时将动物放入激发箱内，并以生理盐水10mL喷雾，每次10min，连续4d。

1.4 治疗方法［3］造模成功后，A组在每日16∶00［属肺经昼夜气血盛峰值申时（15：00-17：00）］电针治疗。B组在每日11∶00［属肺经昼夜气血盛衰非峰非谷值巳时（9：00-11：00）］电针治疗。穴位选取定喘、肺俞、尺泽穴（取穴方法参照《实验针灸学》［4］）。每次治疗10min，每日治疗1次，7d为1疗程，共治疗2疗程。C、D组不给予任何干预治疗。

1.5 标本制备 取材末次治疗后第2日，各组动物麻醉后取出右肺，标本用10%多聚甲醛固定，从固定部位切取右肺组织块。常规石蜡包埋和切片，片厚3μm，分别行HE染色、Masson染色和免疫组化染色。

1.6 检测方法 采用图像分析系统，每张切片在200倍显微镜下，确定完整支气管横截面，分别测取其支气管基底膜周径（Pbm）、支气管总面积（Wat1）、管腔面积（Wat2）和平滑肌面积（WAm），并用Pbm将测量值标化，分别以（Wat1-Wat2）/Pbm和WAm/Pbm表示支气管壁厚度和平滑肌厚度，每个支气管各测5次，取其均值。采用免疫组化测定肺组织中TGF-β1的含量［5］。

1.7 统计学处理 应用SPSS16.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，进行单因素方差分析的SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肺组织大体改变 C组豚鼠肺组织较D组肿胀明显，表面可见瘀紫色暗区，颜色略显苍白，切面可见浑浊分泌物渗出。A、B组有上述改变，但程度轻微。2.2 各组肺组织病理学改变 见图1。C组豚鼠肺组织支气管黏膜肿胀水肿、充血，气道内肥大细胞、肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞与中性粒细胞等炎症细胞浸润，支气管壁和基底膜增厚，支气管管腔变窄，其内可见炎症细胞和分泌物渗出。A、B组豚鼠肺组织炎症细胞浸润等病理改变较C组减轻，且A组要优于B组。D组豚鼠肺组织完整正常，未发现上述情况。

图1 各组气道病理切片（HE染色，200倍）

2.3 各组间支气管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比较 见表1。A、B、C组豚鼠气管壁厚度、平滑肌厚度和TGF-β1均较D组升高，A、B两组与C组比较均有降低，且A组较B组降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组支气管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比较（±s）

表1 各组支气管壁厚度、平滑肌厚度及TGF-β1含量比较（±s）

与D组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.05；与B组比较，▲P＜0.05。

组 别 平滑肌厚度（μm2/μm）气管壁厚度（μm2/μm）TGF-β1A组 4.09±0.11△▲* 5.61±0.26△▲*16.46±0.64△▲*B组 5.02±0.21△* 6.21±0.28△*19.26±0.48△*C组 7.17±0.23* 15.45±0.37*31.68±1.05*D组 3.21±0.13 4.33±0.2910.19±0.10

3 讨 论

气道重塑是指气道组织结构的病理生理改变，以纤维增生，肌成纤维细胞增生、胶原沉积、气道平滑肌细胞增生肥大，网状基底膜的增厚为典型特征，被认为是导致气道不可逆阻塞和气道高反应性的重要原因之一，它在支气管哮喘发病过程中发挥重要作用，可引起哮喘患者症状加重和肺功能降低［6］。而在研究气道重塑中气道结构改变中，有研究表明［7］，可溶性生长因子、细胞因子、炎性介质和酶等多种因素参与气道重建，其中在众多因子中TGF-β1在气道重建中的作用，已被众多学者认可。且TGF-β1是迄今为止发现的细胞外基质沉积最强的促进剂，不仅能刺激成纤维细胞增殖及分泌胶原，还能抑制胶原的降解。可见气道重塑是一个复杂的病理生理过程，其通过调控肺组织的TGF-β1进行表达反应，与气道炎症一样在哮喘的发病机制中扮演着非常重要的角色。

子午流注纳子法是按照一天中的时辰顺序，配合十二经的气血流注，利用五输穴的五行关系，通过子母补泻的方法选穴治疗，其优越性就在于强调选择针治时间的同时亦强调选取适当穴位，从而最大限度地发挥穴位的效应［8］。近年来，遵循中医学“内病外治，殊途同归”等治疗原则，越来越多的中医外治法应用于哮喘的治疗，尤其是纳子针法在临床上取得不错的疗效。很早就有学者提出［9］，支气管哮喘多在后半夜显得厉害，按照子午流注中的“纳子法”，寅时（3∶00-5∶00）乃是气血入肺之时，此时针刺肺经之穴疗效优于他时。而笔者［10］同样发现按时辰取穴的纳子法电针治疗哮喘的疗效优于不按时辰治疗者，并认为其机制可能与降低模型豚鼠气道的EOS计数与凋亡率有关。但由于豚鼠为啮齿类动物，其昼夜活动周期与人类完全相反［11］，故豚鼠肺经昼夜气血盛峰值时辰应为寅时的对时申时（15∶00-17∶00）。故根据纳子法理论，本实验选择肺经昼夜气血盛峰值时辰申时（15∶00-17∶00），与非峰非谷值时辰巳时（9∶00-11∶00），对哮喘豚鼠模型分别采用电针定喘、肺俞、尺泽3穴治疗，以观察择时治疗的效应。

实验结果显示，哮喘豚鼠模型经电针定喘、肺俞、尺泽穴治疗后，豚鼠气管壁厚度及平滑肌厚度增厚均明显减轻，TGF-β1值降低，与模型不治疗组相比有显著差异，说明针灸有抑制平滑肌增殖的作用，减缓了气道重塑的发生。且申时即肺经气血旺盛时施治有良好疗效，证实了择时与不择时治疗之间产生显著性差异，揭示时辰与一定的穴位配伍可产生协同作用，其可能通过制止豚鼠气道重塑来达到治疗目的，提示临床治疗时应尽量采用该疾病所处经脉气血旺的时辰施治。

［1］Royce SG，Cheng V，Samuel CS，et al.The regulation of fibrosis inairway remodeling in asthma［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，351（2）：167-l75.

［2］吕国平，崔德建.介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法［J］.中华结核和呼吸杂志1995，18（6）：377.

［3］邹移海.实验动物学［M］.北京：科学出版社，2008：90-93，152-161，176-203.

［4］李忠仁.实验针灸学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：105.

［5］张玉英，惠朋利.姜辛夏颗粒对哮喘大鼠气道重建TGF-β1表达的影响［J］.时珍国医国药，2012，13（8）：1941-1943.

［6］Halwani R，A1-Muhsen S，Harold Q.Airway remodeling inasthma［J］.Curr Opin Pharmacol，2010，10（3）：236-245.

［7］殷晓峰，冯玉麟.大鼠哮喘模型中转化生长因子-β1对气道重构调节作用的研究［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2002，1（3）：157.

［8］涂乾.子午流注纳支法对大鼠乙酸性胃溃疡愈合质量影响的实验研究［J］.武汉市职工医学院学报，2001，29（3）：21.

［9］马向东，徐球菊.子午流注与支气管哮喘［J］.包头医学，2001，25（3）：124.

［10］蔡彦，陈文裕，陈创荣，等.纳子法电针治疗对哮喘模型豚鼠嗜酸性粒细胞凋亡的影响［J］.广州中医药大学学报，2008，25（2）：124-127.

［11］伊藤真次.人体昼夜节律［M］.重庆：重庆出版社，1983：150-155.

E fects of M idnight-noon and Ebb-flow Acupuncture Therapy on Airway Remodeling in Asthmatic Guinea Pigs

CAI Yan，LI Chutian，LIN Huangguo，et al. Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangdong，Guangzhou 510120，China

Objective：To observe the Midnight-noon and Ebb-flow Acupuncture therapeutic effect on airway remodeling of asthma guinea pig model and to reveal the mechanism of it which provided experimental basis for clinical application of the Midnight-noon Ebb-flow Acupuncture in treatment of asthma.Methods：32 healthy guinea pigs were divided into A group with electroacupuncture in Shen shi group（from 15：00 to 17：00 PM），the B group with electroacupuncture in Si shi Group（from 9：00-11：00），the C group with no treatment and he D group with normal control therapies.And chicken ovalbumin sensitization method was used to copy the model of experimental asthma to observe the 4 groups of guinea pig airway thickness and airway smooth muscle and the change of TGF-β1content in lung tissue.Results：Compared with the C group，intrapulmonary airway wall thickness，smooth muscle thickness and the content of TGF-β1were decreased significantly in the A group and B group（P＜0.01）.And the reductions of thickness and TGF-β1in the A group were more effectively than those in the B group.Conclusion：Electroacupuncture treatment can prevent the occurrence and development of airway remodeling in asthma.It is better efficacy on treating asthma on time that the time points of the Shen shi group of airway remodeling in asthma were better than those of no in accordance with the hour treatment in Si shi group.

Midnight-noon and ebb-flow doctrine；Asthma；Airway remodeling

R246

A

1004-745X（2015）05-0778-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.009

2015-02-24）

广东省中医药管理局课题（20131199）