丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用*

彭 戬程 光马 军王南下

（1.湖北省武汉市东湖医院，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学附属协和医院，湖北 武汉430030）

丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用*

彭 戬1程 光2马 军2王南下2

（1.湖北省武汉市东湖医院，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学附属协和医院，湖北 武汉430030）

目的 探讨丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用及其机制。方法 选取健康成年Wistar大鼠24只，随机分为假休克对照组（Sham组）、模型组（CLP组）、丹参酮ⅡA组（TanⅡA组）3组各8只。脓毒症组和丹参酮ⅡA组采用盲肠结扎穿孔手术（CLP）法制作大鼠脓毒症模型，术后即刻分别腹腔注射20mg/d的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液和生理盐水，对照组仅做盲肠探查术。实验结束时，收集各组肺组织测定肺组织湿/干质量比（W/D），肺组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧自由基（ROS）活性和丙二醛（MDA）含量，光镜下观察各组肺组织形态学改变，采用Western blot检测各组肺组织γ-GCS蛋白的表达。结果 光镜下可见Sham组肺组织结构基本上正常，肺泡结构清晰；CLP组肺组织充血水肿，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，可见部分肺泡塌陷、不张；TanⅡA组肺组织间质稍增厚，少量炎性细胞浸润，肺组织的炎性病理改变较CLP组显著减轻。CLP组、TanⅡA组的肺组织W/D均较Sham组增高，但TanⅡA组的肺组织W/D与CLP组相比较有明显下降（P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的肺组织SOD和GSH活性较Sham组显著降低，但TanⅡA组与CLP组的肺组织SOD和GSH活性比较有明显增高（P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的肺组织MDA含量和ROS活性较Sham组明显增高，但TanⅡA组的肺组织MDA含量和ROS活性较CLP组低（P＜0.05）。Western blot结果示，CLP组、TanⅡA组肺组织γ-GCS蛋白表达低于Sham组（P＜0.05），而TanⅡA组γ-GCS蛋白较CLP组则明显增加（P＜0.05）。结论 丹参酮ⅡA可促进γ-GCS蛋白表达，增加GSH的生成，抑制炎性反应，抑制细胞内脂质过氧化，清除氧自由基，从而减轻脓毒症大鼠的肺损伤。

脓毒症 肺损伤 丹参酮ⅡA

脓毒症是由感染因素诱发的全身炎症反应，是临床常见的危重症之一，如不及时救治，常危及生命，肺常是其首先侵害的器官，其可能与脓毒症的全身性炎症反应导致的氧化/抗氧化失衡有一定的关系［1］。谷胱甘肽（GSH）具有抗氧化作用，是体内的重要抗氧化物之一，在抗氧化、清除氧自由基方面有重要作用。作为GSH合成限速酶的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）是调控GSH生成的速度和量的关键蛋白［2］。丹参酮ⅡA为丹参的有效成分，具有抗氧化、清除氧自由基的作用，但在脓毒症肺损伤的临床应用却较少报道。近年来，有研究报道丹参具有抗内毒素所致急性肺损伤的作用［3］，但具体机制并不清楚。本实验通过建立脓毒症大鼠模型，观察丹参酮Ⅱ是否能通过调控γ-GCS的表达抗氧化、清除氧自由基达到对脓毒症肺损伤的保护的作用，为临床提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试药 24只健康成年Wistar雄性大鼠，体质量200～250 g，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号0056837；丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（诺新康2mL∶10mg，上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022558），兔抗大鼠β-actin、γ-GCS单克隆抗体均购买于美国Santa Cruz公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和GCS试剂盒（南京建成生物有限公司）；其余试剂为国产分析纯（武汉康盛医药科技有限公司）。

1.2 分组与造模、给药 24只Wistar大鼠随机分为3组：对照组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）和丹参酮ⅡA组（TanⅡA组），每组8只。其中CLP组和TanⅡA组大鼠采用盲肠结扎穿孔手术（CLP）法制作大鼠脓毒症模型，术前禁食12 h。10%水合氯醛0.4mL/100 g腹腔注射麻醉成功后仰卧位固定，常规消毒腹部皮肤，于中下腹正中线纵行切开，打开腹腔，充分暴露盲肠，于距盲肠末端1 cm处采用3号缝合线环形结扎，保证肠道通畅，并据结扎处5mm位置采用9号针头贯穿盲肠2次，并轻挤压确保粪便溢出，以进行后续的关闭腹腔手术。术后即刻TanⅡA组和CLP组分别腹腔注射20mg/d的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液和生理盐水，对照组仅做盲肠探查术。术后各组所有药物均处理连续48h，所有大鼠均提供相同环境和饮食，均禁食、自由饮水。

1.3 标本采集与检测 术后48 h处死大鼠，迅速剖胸取肺组织置深低温冻存管于液氮中保存以备用。1）肺组织湿/干质量（W/D）比值测定：处死大鼠后，剖胸取右肺上叶组织，用滤纸吸干肺表面水分，精确称质量后放入烤箱内72 h（60℃），测定W/D比值。2）肺组织病理学观察：取左肺上叶，10%甲醛浸泡固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，分别在光学显微镜观察肺组织形态学改变。3）肺组织SOD、MDA、GCS、活性氧自由基（ROS）的测定：取左下肺组织，制成10%肺组织匀浆。Bradford方法测定蛋白浓度，采用发光法测定SOD，采用比色法测定MDA、ROS、和GCS，按试剂盒说明书操作。4）肺组织γ-GCS的表达：取大鼠右肺下叶肺组织约500mg，提取各组总蛋白，Western blot检测各组γ-GCS的表达。以β-actin为内参，目的蛋白与相应的β-actin吸光度值的比值作为蛋白的相对表达强度。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以（±s）表示，数据采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肺组织形态学改变 见图1。光镜下可见Sham组肺组织结构基本上正常，肺泡结构清晰，肺泡腔及支气管腔未见炎细胞及渗出物，可见少许红细胞；CLP组肺组织充血水肿，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，可见部分肺泡塌陷、不张；TanⅡA组肺组织间质稍增厚，少量炎性细胞浸润，肺组织的炎性病理改变较CLP组显著减轻。

图1 各组肺组织病理学变化（HE染色，200倍）

2.2 各组肺组织GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值的比较 见表1。CLP组、TanⅡA组的肺组织GSH活性较Sham组显著降低 （P＜0.05），但TanⅡA组与CLP组的肺组织GSH活性比较却有明显增高 （P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的肺组织ROS活性较Sham组明显增高 （P＜0.05），但TanⅡA组的肺组织ROS活性较CLP组低 （P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的W/D均较Sham组增高 （P＜0.05），但TanⅡA组的W/D与CLP组相比较明显下降（P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的肺组织SOD活性较Sham组显著降低（P＜0.05），但TanⅡA组与CLP组的肺组织SOD活性比较却有明显增高（P＜0.05）。CLP组、TanⅡA组的肺组织MDA含量较Sham组明显增高（P＜0.05），但TanⅡA组的肺组织MDA含量较CLP组低（P＜0.05）。

表1 各组肺组织GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值比较（±s）

表1 各组肺组织GSH、ROS、W/D、SOD及MDA值比较（±s）

与Sham组比较，*P＜0.05；与CLP组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n GSH（mg/mg） W/D SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）ROS（U/mg）Sham组 821.35±3.41 4.55±0.20 200.05±10.050.83±0.05 7.54±1.26 CLP组 89.45±5.21* 5.92±0.31*153.40±9.07*2.22±0.14* 22.34±3.05*TanⅡA组 815.71±4.35*△ 5.06±0.22*△180.22±6.28*△1.34±0.20*△ 15.01±2.25*△

2.3 各组肺组织γ-GCS蛋白的表达 见表2，图2。Western blot结果及图像分析结果示，CLP组、TanⅡA组肺组织γ-GCS蛋白表达低于Sham组（P＜0.05），而TanⅡA组 γ-GCS蛋白较CLP组则明显增加 （P＜0.05）。

表2 各组肺组织γ-GCS蛋白表达比较（±s）

表2 各组肺组织γ-GCS蛋白表达比较（±s）

组别 n γ-GCS蛋白Sham组 8 CLP组 8 0.612±0.010 0.016±0.004*TanⅡA组 80.325±0.009*△

图2 Western blot检测各组肺组织γ-GCS蛋白的表达

3 讨 论

脓毒症是由感染因素诱发的全身炎症反应，是一种临床常见危急综合征［1］，早期死亡主要原因是由于发生难以控制的全身炎症反应，最终导致全身多脏器功能衰竭，肺常是首先受累的脏器之一。目前普遍认为脓毒症出现的炎性细胞因子导致的氧化/抗氧化失衡是ALI发生的重要原因之一。丹参酮ⅡA作为传统中药丹参的有效成分具有抗炎、抗氧化的作用，目前已广泛应用于临床脓毒症器官保护的综合治疗，并且取得了较好的疗效［3-6］，但其对脓毒症肺损伤的研究较少。

本研究结果示，CLP组的肺组织充血水肿，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，可见部分肺泡塌陷、不张，而且肺组织的W/D较Sham组高。TanⅡA组肺组织间质稍增厚，少量炎性细胞浸润，肺组织的炎性病理改变较CLP组显著减轻，W/D与CLP组相比较有明显下降，提示TanⅡA确能改善脓毒症肺损伤。

研究表明在脓毒症过程中，过度炎症反应和炎症损伤导致肺组织的氧化/抗氧化失衡是ALI发生和进展的关键因素［1，7-8］。MDA含量可以反映脂质过氧化的程度，SOD可以保护细胞不受毒性氧自由基的损伤。CLP组的肺组织MDA含量较Sham组高，但SOD活性较Sham组明显降低，说明脓毒症引发的氧化应激反应，导致了急性肺损伤。TanⅡA组与CLP组的肺组织SOD活性比较却有明显增高，MDA含量较CLP组低，说明TanⅡA能通过降低脓毒症的氧化应激反应达到改善肺损伤的目的。

GSH是体内重要的抗氧化成分之一，在抵御肺的氧化损伤与炎症等方面有显著效果。γ-GCS是GSH合成的限速酶，γ-GCS的高表达可促进GSH合成的增加，从而达到清除ROS，参与ALI的抗氧化的作用［9-11］。本研究结果示，CLP组的肺组织γ-GCS蛋白表达及GSH活性较Sham组降低，ROS活性较Sham组明显增高。TanⅡA处理后，与CLP组的肺组织γ-GCS蛋白表达及GSH活性比较有明显增高，肺组织ROS活性显著降低，提示TanⅡA能通过提高GSH活性达到清除氧自由基，发挥抗氧化的作用，而GSH活性的增高可能是通过提高γ-GCS蛋白表达实现。

综上所述，TanⅡA干预能够通过提高ALI时γ-GCS蛋白的表达，从而增加GSH的合成，清除氧自由基，抑制细胞内脂质过氧化，减轻脓毒症所致的肺组织损伤的程度，起到有效保护作用。

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Protective Effects of Tanshinone Ⅱ A on Acute Lung Injury in Rats with Sepsis

PENG Jian1，CHENG Guang2，MA Jun2，et al. 1 Wuhan Donghu Hospital，Hubei Provicne，Hubei，Wuhan 430074，China；2 Union Hospital Affliliated to Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China

Objective：To study the lung protective effects and mechanism of Tanshinone Ⅱ A on acute lung injury in rats with sepsis.Methods：24 healthy adult wistar rats were randomly divided into 3 groups including sham control group，cecal ligation and puncture operation group（CLP）and Tanshinone Ⅱ A group.Lung tissues were collected at the end of the experiment.Lung tissue wet/dry quality ratio（W/D），the super oxide dismutase（SOD）activity，reactive oxygen species activity（ROS），Glutathione（GSH）activity and malondialdehyde（MDA）content of lung tissue homogenates were determined.Morphological changes of lung tissues were observed under optical microscope，the relative expressions ofγ-GCS protein in lung tissues were detected by western blot.Results：Sham group showed the normal structure of lung tissues and the clear structure of the alveolar under the optical microscope；CLP group showed hyperemia and edema of lung tissues，a large number of inflammatory cells infiltration，broadening alveolar interval，collapse and atelectasis of the alveolar；Tanshinone Ⅱ A group showed that the interstitial lung tissues were slightly thickened，a small amount of inflammatory cells were infiltrated，the inflammatory pathological changes of lung tissues were significantly reduced compared with CLP group.The W/D of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group were higher than Sham group，but those of lung tissues in Tanshinone II A group was significantly lower compared with CLP group（P＜0.05）.The activity of SOD and GSH of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group significantly decreased compared with Sham group，but those of lung tissues in Tanshinone Ⅱ A group was significantly higher compared with CLP group（P＜0.05）.The MDA content and ROS activity of lung tissues in CLP group and Tanshinone Ⅱ A group significantly increasedcompared with Sham group，but those of lung tissue in Tanshinone Ⅱ A group was lower than CLP group（P＜0.05）.Western blot results showed that，compared with Sham group，the relative expressions of γ-GCS protein in CLP group were relatively decreased.Those of Tanshinone Ⅱ A group were significantly increased compared with CLP group（P＜0.05）.Conclusion：Tanshinone Ⅱ A could promote the protein expressions of γ-GCS，increase the production of GSH，inhibit inflammatory reaction，inhibit lipid peroxidation，remove of oxygen free radicals，and thus reduce acute lung injury that induced by Sepsis.

Sepsis；Acute lung injury；Tanshinone Ⅱ A

R285.5

A

1004-745X（2015）05-0766-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.005

2015-02-10）

国家自然科学基金（30500657）；湖北省自然科学基金（2011CDB196）