家蝇抗菌肽对FBL-3红白血病原代细胞增殖影响浓度的探索

杜 斌 赵瑞君** 程璟侠 王文健 原发家 聂守民 李彦红

(1. 山西医科大学基础医学部，寄生虫学教研室，太原 030001; 2. 山西省疾病预防控制中心病媒生物防控科，太原 030001； 3. 山西医科大学附属第二医院心内科, 太原 030001)

昆虫抗菌肽是相对较早涉及肿瘤研究的生物制剂(梅寒芳等，2009)。抗菌肽对肿瘤的抑制及杀伤作用(Suttmannetal.,2008)已有一定研究。本课题组利用家蝇幼虫的抗菌肽粗提物来寻找其最适宜的作用浓度，作为后续动物体内实验的过渡实验。为了模拟到体内环境，本实验通过构建C57BL/6小鼠患红白血病的模型(吴远彬等，2010)并获得FBL-3原代细胞。原代培养最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。

目前国内外研究抗菌肽抗肿瘤机制的实验较多。Biragyn等(2001)用编码非免疫原性淋巴瘤抗原与鼠B-defensin融合蛋白的DNA 质粒免疫大鼠,可在大鼠体内引起明显的IgG 免疫应答和抗肿瘤活性; Xu 等(2007)采用鼠源性B-defensin 2及IL-18 基因共转染L1210 细胞, 免疫大鼠后, 可产生比单独转染B-defensin 2 或IL-18 基因更强烈的抗肿瘤免疫反应。研究抗菌肽对红白血病是否有抑制作用未曾见到报道，本实验的研究旨在寻找疗效好副作用少的新型生物治疗方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1家蝇MuscadomesticaⅢ龄幼虫：多代培养的纯种品系，山西省疾病预防控制中心虫媒科的养蝇室饲养。

1.1.2肿瘤细胞：FBL-3红白血病细胞，由中国医学科学院北京药物所引进；原代FBL-3细胞，通过实验从动物模型取组织并培养获得。

1.1.3C57BL/6小鼠：斯贝福(北京)实验动物科技有限公司。

1.1.4主要试剂及设备：苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)(美国 Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI 1640培养基(北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，青链霉素混合液(10 000 U/mL青霉素和1 000 μg/mL链霉素)，台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(碧云天 Beyotime)， CCK-8试剂盒(碧云天 Beyotime)， Eppendorf Biophotometer D30核酸蛋白测定仪(德国艾本德公司)，奥林巴斯IX83倒置显微镜(奥林巴斯中国有限公司)，Count star自动细胞计数仪，Eon微孔板分光光度计(美国Biotek公司)。

1.2 方法

1.2.1大肠杆菌诱导和匀浆：取家蝇Ⅲ龄幼虫3 g，用昆虫针蘸E.coliDH5a针刺其体壁腹后诱导，每虫1针，处理后置于烧杯内于室内饲养24 h。然后置于预冷的研钵中，按1 g幼虫加入0.5 mL 内含1 mmol/L PMSF的生理盐水，冰浴研磨，于4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，取上清，重复离心2次。

1.2.2Sep-Pak C18柱固相萃取：以5 mL甲醇洗柱，然后以5 mL三蒸水平衡柱体。将上清液4 ℃、12 000 r/min离心30 min。尽量减少杂质，取上清上柱，每柱上样5 mL，以三蒸水洗柱，记为流通液，以5 mL 80 %浓度的乙腈水溶液(三蒸水配制)洗脱柱体，手动收集洗脱组分并保存于-70 ℃冰箱24 h，真空冻干机干燥， 最后用PBS重溶，用核酸蛋白测定仪检测其浓度。

1.2.3动物模型构建：选取6～8周龄C57BL/6雄性小鼠(体重约为20 g)，把处于传代期(对数增长期)FBL-3红白血病细胞经尾静脉注射，注射浓度为2.5×106/mL，剂量为200 μL。约一周后，可以在小鼠腋下摸到质硬边缘整齐的肿块。将3组(每组6只)不同批次C57BL/6雄性小鼠，经相同方法处理，均有肿块出现。

1.2.4FBL-3原代细胞获取及培养：处死小鼠，消毒，于超净工作台剥离腋下肿瘤，保持肿瘤的完整性。剪碎并置于200目滤网上，边研磨边用10 mL无钙镁PBS冲洗，收集研磨液，转入离心管，1 000 r/min 离心5 min。弃上清，加入5 mL红细胞裂解液，约2 min，除去沉淀中的红细胞，加入5 mL无钙镁PBS，离心5 min，1 000 r/min。弃上清，加入完全培养基(培养基∶胎牛血清=9∶1，抗生素1 000 U/10 mL)转入培养瓶，然后置于CO2培养箱培养。

1.2.5倒置显微镜下观察细胞形态：将处于对数期的FBL-3原代细胞经胰酶消化后转移入4个培养皿，约5 000个/皿。加入900 μL完全培养基，各培养皿加入浓度为250、330、420 μg/mL的抗菌肽混合物100 μL，PBS组加入100 μL PBS，培养24 h后于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.6台盼蓝染色检测细胞存活率：用胰酶将培养皿的细胞分别消化置于2 mL离心管，离心，弃上清。再各加 1 mL细胞重悬液。用移液枪吸取100 μL重悬的细胞加入100 μL台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3 min。吸取20 μL经过染色的细胞在自动细胞计数下观察并计算生存率。

1.2.7CCK-8试剂盒检测细胞毒性：胰酶消化处于对数期的FBL-3原代细胞，于96孔板培养，每孔细胞数约为5 000个，加入180 μL完全培养基，再各加20 μL抗菌肽混合物(除对照组)。设置Blank组与实验组，每组设3个复孔。实验组按浓度 150、200、250、300、350、400 μg/mL分为6个梯度，Blank组加20 μL PBS。放到37 ℃、5 %的CO2温箱中培养24 h，之后吸掉原有培养基，每孔再加入200 μL 试剂(180 μL完全培养基和20 μL CCK-8试剂)继续孵育4 h，用酶标仪(Eon)在波长450 nm下检测实验组和对照组的OD值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 倒置显微镜观察不同浓度抗菌肽混合物作用FBL-3原代细胞的结果

将抗菌肽混合物调整浓度(250、330、420 μg/mL)作用处于对数期的FBL-3原代细胞，PBS作为对照，结果如图1所示。图1(a)，作用浓度为250 μg/mL，细胞受损严重，视野中可以看到大量细胞碎片，细胞胞膜不完整，内容物外泄。图1(b)，在330 μg/mL作用下视野中可观察到跟多细胞碎片，而且细胞贴壁情况较差。图1(c，d)，作用浓度为420 μg/mL，一部分细胞碎裂，也有较多细胞处于增殖状态，有贴壁现象。图1(e)，PBS组细胞，细胞形态正常，能够很好的贴壁。

2.2 台盼蓝染色计算细胞的存活率

利用count stars细胞计数仪，经台盼蓝染色可以获知PBS组、150、250、350、450 μg/mL组的FBL-3原代细胞细胞存活率，经SPSS 13.0统计分析软件，如表1。

抗菌肽浓度(μg/mL)Concentrations ofantimicrobial peptide细胞生存率(%, x±s)Survival rate对照组PBS group74.906±0.38815064.713±0.43025031.653±0.54335049.426±0.52145072.790±0.622

2.3 CCK-8检测不同浓度抗菌肽混合物作用下FBL-3原代细胞的细胞毒性

如表2六个浓度组的抗菌肽混合物均可对FBL-3原代细胞带来影响，各实验组与正常组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。250、300、350 μg/mL，两两比较，差异不具有统计学意义(P>0.05)。细胞毒性随抗菌肽混合物浓度的增加先增大后减小，在300 μg/mL作用下，其毒性最大，如图2。

表2 不同浓度抗菌肽混合物对FBL-3原代细胞细胞毒性的影响Tab.2 The change of cytotoxicity of FBL-3 primary cell by different concentrations

* 差异有统计学意义，P<0.05.

* Significant difference,P<0.05.

图2 各浓度抗菌肽混合物作用下的细胞毒性Fig.2 Cytotoxicity by Antimicrobial peptides with different concentrations

3 讨论

昆虫抗菌基因的表达产物有抗菌肽、溶菌素、凝集素、血素等抗菌蛋白和多糖类物质，而其中抗菌肽是最主要的物质。GenBank已注册的家蝇抗菌肽基因有天蚕素cecropin、防御素defensin、攻击素attacin和双翅抗菌肽diptericin 4种。金小宝等(2012)发现家蝇抗菌肽cecropin能够抑制人肺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MCF-7、人宫颈癌细胞株Hela和人肝癌细胞 BEL-7402等人源性肿瘤细胞的生长，并诱导发生凋亡。焦莉萍等(2014)利基因工程技术合成防御素defensin同样也对肝癌细胞HepG2有抑制作用，作用浓度需达到680 μg/mL。通过分子克隆、表达、纯化可以得到纯化单一的抗菌肽，但基因工程技术生产的抗菌肽还有许多尚未解决的问题: 原核表达系统虽然操作简便，但抗菌肽基因作为真核基因在原核系统中表达的蛋白往往不能有效正确的翻译，从而因空间结构上的差异影响表达抗菌肽的活性; 抗菌肽对表达载体都有抗杀作用，表达产物易降解。基于此，本实验选择使用提取量大而且作用效果更加明显的抗菌肽粗提物。修江帆等(2014)研究表明微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高，故本实验参考赵瑞君等(2008)的方法选择大肠杆菌针刺诱导。Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪测定提取得到每3 gⅢ龄幼虫可获得1.5g～2.0 g(浓度为0.6～0.8 mg/mL)的抗菌肽粗提物。表明，传统方法在产量方面有一定的优势。

抗菌肽具有抗肿瘤作用已经被诸多实验证实，但对于其作用于红白血病的研究鲜有，本实验以红白血病原代细胞作为研究对象，其生物特性更接近于生物体内，实验中的数据对动物实验更具有指导意义。

已经证实，Cecropin、Defensin均有抗肿瘤活性，如果二者混合，以混合抗菌肽的形式作用肿瘤细胞将会有怎样的效果，故本实验选择家蝇Ⅲ龄幼虫抗菌肽粗体物来实现二者甚至于4抗菌肽的混合作用于肿瘤细胞。Cecropin A对早幼粒性白血病细胞HL-60 具有抗肿瘤作用(Ceronetal.,2010)。根据MTT 和LDH 实验，CA 作用后细胞活力以剂量依赖方式递减。台盼蓝染色实验以此为参考，但结果如图表1显示在混合物浓度为350 μg/mL时细胞存活率却有提高。继而开展CCK-8检测细胞毒性实验，再次证实当浓度低于300 μg/mL时，对细胞的作用有浓度依赖性。作用于细胞的混合物浓度继续增大，细胞毒性反而减小，如表2和图2所示。以抗菌肽混合物作为实验药物作用FBL-3原代细胞，从显微镜观察图像和CCK-8检测数据及统计学分析，探究得到了FBL-3原代细胞增殖的影响浓度为300 μg/mL，对于动物体内实验具有指导意义。而为什么抗菌肽混合物对FBL-3增殖影响不完全有浓度依赖性，可能与肿瘤细胞的种类相关，也可能与抗菌肽混合物本身的有效成分相关，对此将会做进一步研究。