家蝇幼虫抗菌肽粗提物与8种纯化物对SUP-B15细胞增殖抑制和诱导的凋亡作用

王文健 赵瑞君 李 珀 杜 斌 原发家 聂守民 程璟侠 李彦红

(1. 山西医科大学基础医学部，寄生虫学教研室，太原 030001； 2. 山西省疾病预防控制中心病媒生物防控科，太原 030001; 3.山西医科大学附属第二医院心内科, 太原 030001)

如今临床抗感染治疗中抗生素在面对诸多耐药菌株时已失去昔日的辉煌，青霉素的时代即将逝去，一个崭新的时代就要来临——抗菌肽时代。自Boman等(1980)从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素(Cecropin)抗菌肽A和B,使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识(Hou，2007)。Sup-b15细胞株属于人Ph+急淋白血病(ALL)细胞系。在我国ALL发病率约为0.67/10万。ALL儿童期(0～9岁)为发病高峰，可占儿童白血病的70%以上，ALL在成人中占成人白血病的20%左右。在治疗方面，传统的放化疗副作用太大，这就需要寻找一种更为有效且副作用低的治疗方式。对于家蝇Muscadomestica抗菌肽的研究，赵瑞君等(2007)和丘晓燕等(2003)发现其粗提物对肿瘤细胞109、K562、Daudi、T24、MCF-7、BGC-823、MCC-803、SPA-A-1均有抑制作用，而对正常细胞没有抑制。通过查阅相关的文献资料未发现有关家蝇幼虫抗菌肽对sup-b15细胞及粗提物与纯化物的对比研究。本实验旨在为将来有关这方面的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料：家蝇Muscadomestica三龄幼虫由山西省疾病预防控制中心提供；大肠杆菌由本实验室保存，sup-b15细胞株由山西医学科学研究院血液科惠赠。

1.1.2主要试剂和设备：苯甲基磺酰氟(PMSF)，美国Sigma公司；IMDM培养基，博士德生物；胎牛血清，杭州四季青公司；CCK-8试剂盒，碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒，上海前尘生物科技有限公司；反相高效液相色谱仪TG328B，美国Agilent公司；真空冷冻干燥机 FD-1-50，北京博医康实验仪器有限公司；核酸蛋白测定仪，德国艾本德公司；流式细胞仪 FACS Calibur，B.D Corp，USA。

1.2 方法

1.2.1抗菌肽提取分离纯化：将家蝇三龄幼虫以同等质量随机分成两组，其中一组(诱导组)用昆虫针蘸取大肠杆菌菌液针刺幼虫后腹壁脂肪层，另一组(对照组)不做处理，继续饲养24 h。将两组幼虫分别置于预冷的研钵中冰浴研磨，同时加入m(g)/V(mL)=1/3提取液(内含1 mmol/L PMSF的生理盐水)。研磨后以12 000 r/min，4℃离心30 min，取上清，重复离心3次，4℃保存。经Sep-Pak C18柱固相萃取(樊宏英，2011)得到家蝇幼虫抗菌肽粗提物，保存于-80℃冰箱。利用反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)进行分离纯化，并记录出峰情况，根据出峰时间收集蛋白质并分装标记。再将其与粗提物放入-80℃冰箱预冻24h后置于真空冷冻干燥机浓缩，36 h后用PBS重溶检测浓度，-20℃冷冻保存。

1.2.2CCK-8试剂盒检测细胞增值抑制率：培养sup-b15(悬浮细胞)选用含20%胎牛血清1%双抗的IMDM培养基，置于5%CO2、37℃培养箱，每2～3 d换液，5～6 d传代。取对数生长期细胞，调整浓度至2×104cells/mL，加入96孔板，每孔100 μL，每组平行设置3个复孔。将各组抗菌肽50 μL(100 μg/mL)加入对应孔中，对照组加入50 μL PBS，37℃、5%CO2培养。36 h后(对照组处于细胞对数生长期)向每孔加入15 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，450 nm检测吸光度(OD值)，并记录各组数值。根据公式计算出各组抗菌肽的细胞生存率：细胞生存率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.2.3用Annexin V-FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒检测sup-b15的凋亡率：将对数生长期sup-b15细胞浓度调整为2×106cells/mL，加入24孔板(每孔1 mL),每组设置3个复孔。将0.5 mL终浓度为100 μg/mL的各组抗菌肽加入实验组各孔，对照组每孔加入0.5 mL PBS，37℃、5%CO2培养36 h。待培养完后2 000 r/min、4℃离心5 min，弃上清液收集悬浮细胞，用预冷的PBS洗涤细胞(2 000 r/min、4℃离心5 min)两次，再加入400 μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，收集浓度大约5×105cells/mL。在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育15 min。最后加入10 μL PI染色液轻轻混匀于4℃避光条件下孵育5 min，30 min内用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 抗菌肽分离纯化蛋白RP-HPLC色谱图分析

通过对比两张峰值图发现，图1-B中保留时间为3.741、7.499、32.746、33.318的峰值较图1-A明显增高，说明这些蛋白质在诱导刺激后表达量显著增加；图1-B较图1-A新出现了保留时间为4.973、12.209、14.982、15.240的峰，说明经诱导刺激后有新生成的蛋白质产生。这些蛋白即为实验进一步研究的家蝇幼虫纯化抗菌肽。为此我们将含量增加(Increased)保留时间为3.741、7.499、32.746、33.318的蛋白按顺序分别标记为I1、I2、I3、I4组；新生成(Generate)保留时间为4.973、12.209、14.982、15.240的蛋白按顺序分别标记为G1、G2、G3、G4组；诱导组抗菌肽粗提物(Extracts)标记为E0组。

2.2 CCK-8试剂盒检测家蝇幼虫抗菌肽对sup-b15细胞生长抑制

CCK8结果显示，与对照组相比，I1、I2、I4、G2、E0组细胞生长得到明显抑制，五组细胞的生存率(图2)分别为0.714±0.032、0.785±0.023、0.641±0.065、0.686±0.034、0.561±0.025,差异具有统计学意义(P<0.05)，其余组与对照组相比，差异不具有统计学意义(P>0.05)。

图1 RP-HPLC色谱图(A：对照组B：诱导组)Fig.1 RP-HPLC chromatogram (A: Control group B: Induction group)

2.3 流式细胞仪检测家蝇幼虫抗菌肽对sup-b15细胞引起的细胞凋亡作用结果

我们根据CCK-8检测结果，选取对细胞生长抑制明显的I1、I2、I4、G2、E0五组进行流式实验，结果(图3，表1)经卡方检验组间比较可得，I1、I2、I4、G2、E0组对sup-b15细胞均具有一定的促凋亡作用，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。其中，E0组细胞凋亡明显，而I1、I2、I4、G2组促凋亡作用均弱于E0组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表 1 各组抗菌肽作用sup-b15细胞凋亡结果Tab.1 Apoptotic role of antimicrobial peptides sup-b15

图2 各组抗菌肽作用sup-b15细胞的生存率Fig.2 Cell survival of antimicrobial peptides in each group sup-b15其中横坐标1～9分别代表I1、I2、I3、I4、G1、G2、G3、G4、E0组。1-9 in the abscissa represent I1, I2, I3, I4, G1, G2, G3, G4, E0 group.

图3 各组抗菌肽对sup-b15细胞的凋亡作用Fig.3 Apoptosis in each group of antimicrobial peptides sup-b15 cells其中图ABCDEF分别代表对照组、I1、I2、I4、G2、E0组ABCDEF represent the control group, I1, I2, I4, G2, E0 group， respectively.

3 讨论

近年来国内外有许多学者一直致力于抗菌肽的研究中，已从多种生物体内(如昆虫、植物、动物及人体内)提取出抗菌肽。在ANTIMIC(目前最大的抗菌肽数据库)已收录抗菌肽种类达1 700余种(均为非人工合成、自然存在的抗菌肽)。在SAPD数据库现已收录246种不同的人工抗菌肽(Suttmannetal.，2008)，目前已分离、有些已测定了氨基酸序列的昆虫抗菌肽达到100余种,其中蝇类就达17种(李改瑞等，2010)。家蝇有着能够在杂菌横生的环境里生长但自身却很少因患病而死亡的特点，以及在我国分布广、数量多、容易养殖、成本低等诸多优点，这就使得家蝇抗菌肽对我们更有科研意义和医用价值。然而随着家蝇抗菌肽对于肿瘤的研究不断深入预示其作为抗肿瘤药物，有着广阔的开发应用前景。

实验结果证明了家蝇幼虫抗菌肽对sup-b15细胞有增殖抑制及诱导凋亡的作用。而且在利用RP-HPLC对抗菌肽粗提物分离纯化实验的环节上加设了对照组，较樊宏英等(2011)、魏洪等(2011)的方法更具有科学性，实验通过诱导组与未诱导组的对比证明了目的蛋白是通过诱导产生或诱导之后含量是明显增加的，而并非家蝇幼虫本身就存在或诱导无差异。实验利用CCK-8、流式细胞术对分离纯化目的蛋白进行检测，结果显示目的蛋白确实对sup-b15细胞有增殖抑制和诱导凋亡的作用，这与金小宝等(2012)、程璟侠等(2014)用纯化抗菌肽作用诸多肿瘤细胞的结果相符。

研究过程中发现，并非所有目的蛋白对sup-b15细胞的抑制作用均具有统计学意义(P<0.05)，有些甚至促进其生长(生存率>1，如G3组蛋白)，根据检测结果说明粗提物对肿瘤细胞的作用效果较纯化蛋白明显。本实验以质量浓度为单位，在相同条件下粗提物各有效成分含量均低于纯化蛋白，作用效果应低于纯化蛋白，但实验结果显示却与之相反。这与提纯的中药成分往往不如“本草”的疗效具有相似性，还需要通过实验进行深一步的研究。发现，抗菌肽的抗肿瘤机制比较复杂，迄今为止仍没有一种公认的学说能够阐明抗菌肽抗肿瘤的作用机制(王芳和张双全，1999；张双全等，2002；金小宝等，2011；夏丽洁等，2014)，归纳总结其机制主要是通过接触性抑制和非接触性抑制两个方面杀伤肿瘤细胞(Orsolicetal.，2005)。抗菌肽粗提物成分中有一些蛋白能够直接杀伤肿瘤细胞，而另一些对其不产生抑制作用的蛋白在整个反应过程中又扮演什么样的角色？虽然抗菌肽相关文献还没有这方面的相关报道，但是在查看抗菌肽抑菌作用的论文时得到不少启示：几种蛋白之间类似于抗菌肽和抗生素联合作用抑菌时存在协同作用(刘倚帆等，2010；宫霞等，2005)；某些蛋白对其他有直接抑杀作用的蛋白起到表达调控的作用(张龚炜等，2009)；作为佐剂(陈立春，2012)在免疫表达方面起到至关重要的作用；作为酶起到催化作用，促进有抑制作用的蛋白产生功效；其中两种，甚至几种无效的蛋白之间存在聚合反应从而抑制肿瘤；是凋亡细胞产生的物质激活了原先无效的蛋白。以上是一些具有可能性的预想，还需要进一步的研究来论证。虽然目前对蝇源抗菌肽各方面的研究还不够透彻，更缺乏临床实验作为理论依据，相信在不久的将来抗菌肽将以其独特的优点为人类服务的。