皮毛企业重金属污染调查及Cr还原菌还原能力的测定

张信聪 魏淑珍

皮毛企业重金属污染调查及Cr还原菌还原能力的测定

张信聪 魏淑珍

本文通过对枣强、辛集皮毛企业周围土壤重金属污染状况调查，了解了皮毛企业重金属污染的现状及原因。通过对筛选到的Cr还原菌YGD8还原能力的测定，以期为重金属Cr污染土壤及其他环境重金属污染生物修复提供科学依据，同时丰富了微生物细胞表面展示技术基因工程菌菌种资源。

皮毛加工过程中要排放含Cr的废水，重金属Cr在环境中不容易还原。重金属污染很难自然清除，常采用的物理、生物、化学等手段进行修复。生物修复包括微生物修复、动物修复、植物修复。微生物修复是利用微生物对重金属的沉淀、吸收、氧化还原等作用来降低其毒性。微生物活动通过影响植物根系分泌吸收进而影响土壤对重金属的价态和吸附，以降低重金属的生物有效性。微生物修复处理效果好，费用低，操作简单，可以就地进行处理，对环境影响低。因此，通过生物技术培育修复效率高、适应能力强的微生物，对污染的治理有重要意义。随着世界经济逐步发展，人类活动也逐步增强，采矿、印染、化工等工业带来的三废排放超标，农用化学品使用过量也造成环境的严重污染，特别是重金属的污染愈发严重。目前最引人关注、污染最广、毒性最大的有汞、镉、Cr、铅、砷等。农业部调查显示，在约140万 hm2的污水灌区域中，受重金属污染的土地面积占污水灌面积的64.8％，对人类健康造成极大危害。因此，对重金属污染的调查及脱污修复，对保护生态环境、呵护人类健康意义重大。

试验与方法

采样点的选择

选择枣强、辛集代表性皮毛企业周围为采样点。每个地点以S形分别选择三个样点，在各样点上用铁铲取5～15 cm深的土壤，约500 g。在塑料薄膜上将各样点土壤均匀混合，最后将样品装入样袋，贴好标签，带回实验室。

土样的预处理

将样品在室内自然晾干，并不断翻拌、压碎，拣出沙砾、植物残体及碎石等杂质。然后进行样品细磨，先过20 目尼龙筛，再进一步研碎后通过100 目尼龙筛。将经过细磨的样品，分装于样品袋，贴好标签，备用。

重金属含量测定

土壤消化方法如下：准确称取 0.1 g土壤放入聚四氟乙烯消解罐中，用1 mL蒸馏水湿润后，加入5 mL盐酸，加热至120℃使样品初步分解，当蒸发至2 mL时，冷却至常温，加入2 mL HF和5 mL HNO3，2 mL HClO4加热至120℃保持1 h，直至样品完全消解，加热至150℃赶酸，直至剩余约为1 mL，冷却，去离子水定容备测。

用火焰原子吸收光谱法进行重金属含量的检测。每个样品做三个重复，取平均值，作为最终检测结果。

土壤重金属测定：质量标准参照《土壤环境监测技术规范》，使用GBW-07427标准土壤作为标准物质，测定重金属回收率，并将回收率控制在90％～105％之间。每批消化样品均带2个空白样品及20％的平行样，使批次内相对标准偏差小于25％，批次间质控样品各元素相对偏差小于30％。

培养基的配置

根据重金属污染调查结果，对重金属超标相对严重的作为目的物，配制相应培养基。

还原Cr的培养基配制：牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10.0 g，NaCl 2.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖4.0 g，H2O 1000 mL，调节pH值至7.6。分别加入不同量的10％重铬酸钾，使Cr浓度达到50～1000 mg/L，然后用水浴将其加热到80℃左右，其间要不断用玻璃棒搅拌，直至琼脂全部溶解，再分装于三角瓶和试管中，在121℃下灭菌30 min。

Cr还原菌的筛选

对采集到的样本，每个样本用电子天平称取10.0 g，然后分别放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，在旋转式摇床上150 r/min， 30℃振荡培养30 min，使细菌充分悬浮出来。在无菌条件下，将吸取1.0 mL土壤稀释液注入盛有9.0 mL无菌水的试管中，反复三次，充分混匀。然后再从该试管中吸取1.0 mL溶液，注入另一支盛有9.0 mL无菌水的试管中，并依次制成10-1，10-2，10-3，不同浓度的稀释液。

无菌条件下，分别吸取10-2、10-3两稀释度的土壤悬液0.2 mL涂布于Cr（Ⅵ）浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基，用涂布棒涂布均匀。每种浓度的平板分别做三个重复，并同时做空白对照，在30℃恒温箱中倒置培养，直至长出菌落并对菌落生长情况进行观察。

菌种纯化及驯化筛选

将筛选出长势较好的菌株经Cr（Ⅵ）在液体培养基中梯度压力式驯化法驯化，Cr（Ⅵ）浓度梯度依次为2～60 mmol/L，于30℃条件下培养，并对生长情况进行观察，将在含有高浓度重金属离子的培养基中生长的单菌落挑取出来，在液体培养基中进行富集培养，然后在固体培养基上划线分离，重复2～3遍，直至获得对Cr（Ⅵ）具有高抗性的目的菌株。

Cr还原菌分子生物学鉴定

选出对Cr抗性最强的菌株，对其进行分子生物学鉴定。

依据细菌16S rDNA中最保守序列设计并合成一对引物，引物序列分别为：正向引物（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）；反向引物（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）。其中100 μL的PCR反应体系为：引物3 μL、dNTP 10 μL和Taq酶0.5 μL、10×PCR缓冲液5 μL、模板2 μL、ddH2O 80μL。所选择的PCR程序为：预变性：94℃，3 min；变性：94℃，30 s；退火：56℃，1 min；延伸：72℃，2 min。循环次数为35次，最后再进行72℃延伸10 min。16S rDNA PCR扩增的产物首先要利用琼脂糖凝胶进行回收，然后将回收到的产物用T4连接酶连接到pMD18-T载体（由大连宝生物公司提供）上，并在适宜的条件下转化感受态细胞DH5a，经PCR鉴定阳性的送样到北京三博远志生物技术有限公司完成测序。最后将测定得到的相关序列提交到NCBI的GenBank数据库中，与数据库中已有的16S rDNA序列进行同源性比较分析。

Cr还原菌生理生化特性研究

用生化试剂盒对Cr还原能力强的菌株进行相关生理生化试验。

Cr还原菌生长曲线测定

将对数生长期的Cr还原菌的菌悬液按1％的接种量分别接种到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培养基中中，30℃震荡培养，分别在0、6、12、18、24、36、48 h后取样，用分光光度计于600 nm处测定OD值。

Cr细菌对Cr（Ⅵ）还原能力的测定

将菌株接种到不含重金属离子的培养液中，培养48 h后（稳定期），在YGD8的菌悬液中加入Cr（Ⅵ）使其终浓度为10 mmol/L，继续培养并在0、6、12、18、24 h后取样，经10000 r/min离心2 min后取上清液，并使用原子吸收光谱测定金属离子含量。

试验结果与分析

土壤重金属污染分析

土壤评价标准采用国家《土壤重金属污染评价标准》（GB 15618-1995）中的标准，国家土壤环境质量标准。

图1～图5为一年内枣强和辛集不同企业Cr、Zn、Pb、Cu、Cd五种金属随时间变化的曲线，每个值为各县三个企业的平均值。综合以上数据可知，在12个月份中，各种重金属含量变化并不大，但在雨季，如7～9月份，重金属含量有下降趋势，主要是夏季温度适合Cr还原菌的生长，少量Cr被还原，雨水的增多使含Cr区域面积不断增大，土壤Cr含量相对降低。

图1 各地区各月份Cr含量平均变化值

图2 各地区各月份Zn含量平均变化值

图3 各地区各月份Cd含量平均变化值

图4 各地区各月份Cu含量平均变化值

图5 各地区各月份Pb含量平均变化值

由图1可知，枣强和辛集Cr含量严重超标，其含量远远超过三级土壤的标准；由图2知，辛集Zn含量已经超标。出现此种状况的原因，是枣强和辛集制革企业较多，特别是枣强大营为世界裘皮之都，裘皮生产量很高，含Cr废水的排放造成了土壤中重金属的污染，而对于辛集，随着辛集市暖气企业规模不断扩大，镀Zn的大量使用，是造成土壤Zn污染的主要原因，另外，有机肥、化肥和Cr的大量使用也是土壤中Zn污染的重要途径。

重金属细菌筛选

经过多次传代驯化，反复平板涂布，分离纯化到1株对重金属Cr具较高还原能力的菌株，命名为YGD8，对Cr的耐受性为20 mmol/L。

YGD8菌株16S rDNA测序结果

通过对菌株YGD8的16S rDNA进行测序和同源性比较，发现它与荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescnes）的同源性达到99％，该菌株被鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescnes）。

YGD8生理生化特性

表1为该菌生理生化鉴定结果，生长温度范围为4～37℃，最适生长温度为25～30℃，能够利用L-阿拉伯糖、蔗糖、精氨酸盐、丙酸盐、丁酸盐、山梨醇和阿东醇，而不可利用丙二醇和乙醇。

表1 YGD8菌株的生理生化特性

图6 Cr（Ⅵ）生长曲线

图7 Cr（Ⅵ）还原曲线

YGD8生长曲线测定

在30℃条件下，将对数生长期的YGD8菌株分别接种到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培养基中中，然后分别在0、6、12、18、24 h、36、48 h后取样，用分光光度计于600 nm处测定OD值，绘制生长曲线如图6所示。发现低浓度的Cr（Ⅵ）对YGD8的生长具有促进作用，而高浓度则抑制菌株的生长，并且在添加Cr（Ⅵ）10 mmol/L，YGD8生长效果最好，见图6。

YGD8还原能力的测定

将YGD8菌株接种到不含重铬酸钾的培养液中，培养48 h后（稳定期），加入重铬酸钾使其终浓度为10 mmol/L，继续培养0、6、12、24、36、48 h后取样，经10000 r/min离心2 min后取上清液，原子吸收法测定培养液中Cr的含量，其还原率为86.2％，结果见图7

结语

本文以河北省衡水市枣强及石家庄市辛集代表性皮毛企业周围土壤为试验材料，利用2014年12个月的时间分别在枣强、辛集两个地点典型工业区附近采集土壤样本，每个地点选择三个企业，每个企业选择三个样点进行采集。利用火焰原子吸收光谱法测定土壤样品中重金属元素Pb、Cd、Cu、Cr、Zn的含量。从衡水枣强、石家庄辛集采集到的重金属污染土壤中筛选重金属Cr的还原菌，对抗性强的菌株，鉴定其在分类学上的地位，进行还原能力的测定，分别绘制其生长曲线和还原曲线。得出以下结论：（1）一年12个月内，7～9月，枣强重金属Cr含量有下降的趋势，其他月份重金属Cr含量变化幅度不是很大。（2）枣强地区Cr含量超标相对严重，辛集Cr含量超标，Zn含量略高，枣强、辛集其余重金属不超标。（3）分离纯化到1株对重金属Cr具较高抗性的菌株，经鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescnes），命名为YGD8，实验室条件下YGD8对Cr的还原率为86.2％。该株菌是理想的重金属修复的受体工程菌，可应用于水体和土壤的重金属Cr污染的修复。特别是作为土著菌株对河北皮毛等企业的重金属Cr污染的治理更具有针对性。

随着城市化进程的加速，土壤重金属污染在加剧，从广大城镇居民的生活饮食健康考虑，加强城市周边土壤污染调查和从土壤污染的预防和治理的角度进行土地规划和利用势在必行。各工业区应继续严格执行国家颁布的工业“三废”排放标准和推广清洁生产，并尽可能采用生物还原的方法，使污染控制在国家排放标准以内。同时对已经污染的土壤利用生物恢复技术及时治理，重金属还原菌的筛选能为土壤生物恢复提供菌种资源，提高微生物对重金属的吸附作用，是重金属污染微生物修复的关键技术之一。

10.3969/j.issn.1001-8972.2015.23.003