气阴两虚型心衰病证结合小鼠模型的构建与评价*

杨　鸣　王达洋　龚嫒媛　雷　畅　王延雷　郭淑贞

（北京中医药大学基础医学院，北京100029）

·研究报告·

气阴两虚型心衰病证结合小鼠模型的构建与评价*

杨鸣王达洋龚嫒媛雷畅王延雷郭淑贞△

（北京中医药大学基础医学院，北京100029）

目的探究“气阴两虚型心衰病证结合模型”的构建与评价。方法首先探究过量异丙肾上腺素（ISO）造成心衰小鼠模型的方案，以超声心动、脏器指数、病理切片等明确ISO剂量；在此基础上，联合剥夺睡眠的方式，构建气阴两虚型心衰病证结合小鼠模型，并通过观察宏观体征、图像处理量化分析、旷场实验等评价模型。结果递减剂量组（第1天20 mg/kg，第2天10 mg/kg，第3～14天5 mg/kg）相比恒定剂量组（ISO 5 mg/kg连续30 d）心衰更显著；剥夺睡眠组相比单纯注射ISO组气阴两虚程度更明显。结论联合皮下注射异丙肾上腺素和小站台水环境法剥夺睡眠可构建气阴两虚型心衰病证结合小鼠模型。

病证结合气阴两虚心衰动物模型小鼠

慢性心力衰竭（CHF）是各种心脏病的严重阶段。近年来心衰发病率持续增长，正成为21世纪最重要的心血管病症。国内研究发现，我国心衰患病率约为0.9%，并且发病率逐年上升［1］。根据中医辨证，在众多CHF患者中，出现心悸，胸闷，气短，活动后加重，胸胁满闷，舌质淡红、脉沉细或沉涩等气阴两虚证的症状者较多［2］，故在《实用中医心病学》《中药新药治疗充血性心力衰竭的临床研究指导原则》等文献研究中，气阴两虚型属于其中较常见之一。研究表明，在心衰发展的前期，患者往往呈现气阴两虚证的表现，故复制该模型在对心衰的早期干预较有意义［3-4］。现在与CHF相关的动物实验中，气阴两虚型心衰的动物模型复制方法尚不明确。在中医科研中，动物实验模型的评价方法多样，如方证相关［5］，然而常忽略模型外在的宏观体征，不符合中医辨证的整体观念。本实验拟采用过量异丙肾上腺素（ISO）可复制心衰模型的方法［6-12］，联合剥夺睡眠的病因造模方式［13］，探索气阴两虚型心衰小鼠模型的构建与评价。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康的雄昆明小鼠，体质量18～20 g。合格证编号：11400700019190。自由饮水和摄食，光照24 h，室温（21±1）℃，湿度（50±1）%。

1.2试剂与仪器异丙肾上腺素（ISO）（上海泛柯实业有限公司提供）。VisualSonics Vevo2100超声仪配有30 MHz探头。

1.3分组与造模动物造模实验，根据体质量将实验动物随机分为3组：对照组、递减剂量组（第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg）、恒定剂量组（ISO 5 mg/kg连续30 d），每组7只，实验结束后各组动物数分别为对照组7只、递减剂量组6只、恒定剂量组6只。心衰模型制备，分组当天皮下注射Iso，对照组皮下注射生理盐水，每日1次，连续30 d。参考实验一的结果确定心衰造模方法，另一组实验分为对照组、模型组（递减给予ISO）、（递减给予ISO）+剥夺睡眠组，每组10只小鼠，观察联合睡眠干预对模型小鼠的影响，增加剥夺睡眠干预的实验，从第31日开始，ISO联合剥夺睡眠组采用小站台水环境法［14-15］剥夺睡眠，时间为48 h。实验结束后各组动物数分别为对照组10只、模型组8只、ISO加睡眠剥夺组9只。

1.4观察指标心衰小鼠模型的评价，超声心动检测应用VisualSonics Vevo2100超声仪及30MHz探头于造模结束后第12周对小鼠做超声检查。脏器指数，小鼠取血后，游离心脏、肝、肺，肉眼观察，在4℃的0.9%氯化钠溶液中洗净血液，滤纸吸干，用分析天平称取心、肝、肺质量，测量小鼠胫骨长度，分别计算心肝肺与体重和胫骨长的比值。病理组织学，心肌组织取材，常规石蜡包埋、HE染色，光镜下观察组织病理变化。另一组实验心衰的气阴两虚证型的评价，宏观体征观察依据自创的宏观体征采集量表，定期收集整理小鼠宏观体征，包括精神、活动、毛发、口鼻、耳、爪和尾的情况。为减少主观性，制定了小鼠观察标准，并保证观察记录人员固定。旷场试验，剥夺睡眠后，测定小鼠旷场中1 min水平移动距离及抬头次数。旷场大小为50 cm×50 cm，其底部为1 cm×1 cm方格。每只测量结束后清理旷场，以免气味干扰。根据方肇勤等［16］方法计算气虚程度。气盛衰度=各动物水平/正常组均数×0.6+各动物直立/正常组均数×0.4。图像处理量化分析宏观体征，戊巴比妥钠将小鼠麻醉，参考林志健等［17］的方法，运用Photoshop7.0软件提取小鼠耳、口唇、舌、爪、尾的R、G、B值，并计算上述各部分红色度r=R/（R+G+ B），绿色度g=G/（R+G+B），蓝色度b=B/（R+G+B）。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐者改用秩和检验的Kruskal-Wallish方法进行多个样本比较及两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组心衰模型动物心脏结构与心功能结果比较见表1。12周末，实验组小鼠左室舒张期内径（LVID；d）、左室收缩期内径（LVID；s）较对照组有所增大，左室射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）较对照组有所降低（P＜0.05）。

表1　各组小鼠12周末二维超声心动图比较（）

表1　各组小鼠12周末二维超声心动图比较（）

与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n LVID；d（mm）LVID；s（mm）EF（%）FS（%）对照组7递减剂量组6 4.578±0.1472.898±0.31666.075±8.59836.702±6.645 5.238±0.538△3.949±0.729△△48.834±10.371△△25.109±6.390△△恒定剂量组64.556±0.6423.510±0.626△46.475±8.757△△23.285±5.040△△

2.2各组心衰模型动物脏器指数比较见表2，表3。递减剂量组与对照组相比，心重/胫骨长、肺重/胫骨长均有显著增加（P＜0.05），肺淤血相对肝淤血更明显，显示此模型引起的心力衰竭可能为左心衰。

表2　各组心、肝、肺质量指数比较（）

表2　各组心、肝、肺质量指数比较（）

组别n 心质量指数肝质量指数肺质量指数对照组7递减剂量组6 0.0046±0.00040.0369±0.00320.0046±0.0004 0.0053±0.00070.0381±0.00180.0053±0.0006恒定剂量组60.0045±0.00050.0344±0.00350.0045±0.0007

表3　各组心、肝、肺质量/胫骨长比较（g/mm，）

表3　各组心、肝、肺质量/胫骨长比较（g/mm，）

组别n 心质量/胫骨长肝质量/胫骨长肺质量/胫骨长对照组7递减剂量组6 0.0093±0.00080.0746±0.0086 0.0093±0.0005 0.0111±0.0016△0.0809±0.0062 0.0112±0.0019△恒定剂量组60.0090±0.00110.0688±0.0087 0.0090±0.0019

2.3心衰模型动物病理结果见图1。光镜下可见实验组均有不同程度的纤维化、淋巴细胞聚集。

图1　光镜下HE染色

2.4心衰模型动物联合睡眠剥夺干预宏观体征观察见表4。实验组与对照组相比，渐进性出现精神萎靡，反应迟钝，毛色略有干枯、发黄，口鼻暗红，耳部血管充盈明显，爪、尾均有不同程度的变暗，少光泽。结果显示ISO+剥夺睡眠组耳部g值、尾部r值、吻部r值偏小，舌g值、吻部b值偏大，ISO组舌g值偏小，差异有统计学意义（P＜0.05）。r值愈大愈红，愈小则愈淡。g值愈大则愈暗，愈小则相反。b值愈大则愈青紫，愈小则相反。故剥夺睡眠组尾部与吻部r值偏小，表明气虚；舌g值与吻部b值偏大，表明有阴虚血瘀的倾向。可见剥夺睡眠的造模因素对于体征的影响比单纯ISO注射组更显著。

表4　两组小鼠耳、爪颜色色度、舌、吻部颜色色度及尾色色度分析结果比较（%，±s）

表4　两组小鼠耳、爪颜色色度、舌、吻部颜色色度及尾色色度分析结果比较（%，±s）

吻部尾46.39±3.4138.15±1.11 28.30±3.5732.39±0.99 25.32±1.2829.47±1.56 ISO+剥夺睡眠组r36.99±1.5242.72±1.4943.10±1.4543.09±2.62△36.73±1.27△（n＝8）g32.65±0.4028.61±0.7228.29±1.13△29.43±3.0232.69±0.21 b30.36±1.4928.67±0.8328.61±0.6527.48±2.89△30.59±1.24 ISO组r37.54±0.4242.85±4.6342.99±4.4146.70±1.4137.63±0.61（n＝9）g32.90±0.35*28.54±2.1928.79±2.23△27.23±0.8132.05±0.95 b29.56±0.2728.61±2.4928.21±3.1826.06±0.7930.31±1.31组别对照组r（n＝10）g b耳爪舌37.11±1.1545.05±1.7447.29±7.48 32.96±0.4627.77±0.6824.62±3.67 29.64±0.9327.18±1.0728.09±3.99

2.5各组实验动物旷场试验结果见图2。ISO联合剥夺睡眠组在剥夺睡眠后，运动能力明显下降，ISO组与对照组相比，气盛衰度稍有下降。

图2　气盛衰度

3　讨论

3.1模型构建模拟心力衰竭模型的方法有很多，在目前的研究中大致分为手术法和药物注射法两大类。其中药物注射法中常用的药物有ISO、阿霉素、戊巴比妥钠等。其中ISO能够增强心肌收缩力，模拟压力超负荷型心力衰竭心肌细胞代偿与失代偿的过程，具有无创，安全性高，动物均一性好的特点，在目前的心里衰竭动物模型中较广泛使用。目前国内外已经有许多相关的研究，注射方法大多为皮下注射，腹腔注射，此外也有静脉持续点滴ISO造模成功的研究。但是具体的造模剂量各不相同且差异较大，为进一步确定合适的造模剂量，并探索在心衰发病过程中各中医证型出现的时间窗，本实验以连续30 d，5 mg/kg（小剂量）和第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg（递减剂量）两种方法给予小鼠皮下注射ISO。从中医病因的角度分析，睡眠剥夺会打破机体原有的平衡，导致营卫失调、脏腑功能紊乱，卫阳不得入于阴分，从而灼伤营血，进而出现气阴两虚的症状及体征。目前剥夺睡眠的方法较多，其中小站台水环境法是用于剥夺睡眠较为流行的方法，简单易行，可作为中医病因的造模因素，复制气阴两虚状态的小鼠模型。因此本实验根据上述原理，使用注射ISO结合剥夺睡眠方法，成功复制出气阴两虚证小鼠心力衰竭模型，并且探究出具体注射剂量以及剥夺睡眠的方法，具有较高可行性和可复制性。

3.2模型评价在对于心力衰竭模型的评价中，常用的评价方法为超声心动、脏器指数及病理，本实验在脏器指数的评价中采用较为创新的脏器重量/胫骨长作为脏器指数的方法，有效避免了小鼠个体营养差异造成的实验结果误差，优于传统的脏器重量/体重的评价方法。同时，对于中医证候动物模型评价的探索是基础研究及中药新药研发的重要工具。本实验基于临床，结合图像技术挖掘小鼠体征的细微变化，并引入旷场试验等方法动态评价气与阴的盛衰程度，模拟临床辨证方法，从正面对小鼠进行辨证。此法本于中医理论，更符合中医“整体观念”“司外揣内”的辨证思维模式。图像处理的方法是“望诊”的延伸，将其精确量化，分辨细微的差别，故更需要保证光源、角度、相机参数等其他要素的一致性。剥夺睡眠组尾、吻部红色度偏淡，提示气虚；两实验组小鼠舌色与对照组相比，均有不同程度偏暗，剥夺睡眠组吻部蓝色度偏高，提示阴虚荣养不足，并有血瘀倾向。故各组小鼠耳、爪、尾、舌、吻部的色度分析结果基本符合气阴两虚的特点。旷场试验是衡量小鼠活跃程度的重要参考，实验发现剥夺睡眠后的小鼠活跃程度明显降低，气虚较重，而未剥夺睡眠的实验组与对照组差异较小，且符合统计学差异，故可证明该方法在评价气阴两虚程度中起到关键作用。

综上，本实验采用的评价方法弥补传统评价方法的不足，并做到中西医结合评价心衰程度及气阴两虚程度，具有创新性及客观性。

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The Construction and Evaluation of the Qi and Yin Deficiency Pattern of Hart Failure Mouse Model

YANG Ming，WANG Dayang，GONG Aiyuan，et al.
School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective：To explore the construction and evaluation of the Qi and Yin deficiency pattern of heart failure mouse model.Methods：The programme of excess isoproterenol mouse model with heart failure was explored，valued by ultrasonic cardiography，organ index and pathology.On the basis of the heart failure mouse model，sleep deprivation way was combined to build the Qi and Yin deficiency pattern of heart failure rat model and the model was evaluated by observing macroscopic signs，open-field test，and image processing quantification analysis.Results：The dose decreasing group（the 1st day 20 mg/kg，the 2nd day 10 mg/kg，from 3rd to 14th day 5 mg/kg）had a severer heart failure compared with the dose constant group，（ISO 5 mg/kg for 30 days）and the group of sleep deprivation had a higher degree on Qi and Yin deficiency.Conclusion：Subcutaneous injection of isoproterenol combined with small platform water environment to perform sleep deprivation can build Qi and Yin Deficiency type of mouse model with heart failure disease and syndrome.

The combination of disease and syndrome；Qi and Yin deficiency；Heart failure；Animal model；Mice

R285，5

A

1004-745X（2015）12-2076-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.003

2015-08-03）

教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-13-0692）；北京中医药大学国家级大学生创新训练计划项目（201310026046）

（电子邮箱：guoshz@bucm.edu.cn）