活化抗原CD69、HLA-DR在寻常性银屑病外周血单一核细胞和皮损中的表达

陈文娟 顾俊瑛 龚瑜 刘至昱 许辉 熊惠姊 史玉玲

活化抗原CD69、HLA-DR在寻常性银屑病外周血单一核细胞和皮损中的表达

陈文娟 顾俊瑛 龚瑜 刘至昱 许辉 熊惠姊 史玉玲

目的 探讨活化抗原CD69和HLA-DR在寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞和皮损中的表达变化。方法 流式细胞仪检测20例寻常性银屑病患者和20例健康对照外周血CD3+T细胞中CD69和HLA-DR的表达，同时采用免疫组化的方法检测15例寻常性银屑病患者和10例健康对照皮损组织中HLADR的表达并进行对比。两组统计学分析采用双侧t检验。结果 CD69和HLA-DR在寻常性银屑病患者外周血CD3+T细胞中的表达率分别为（4.70±1.90）%、（8.97±1.79）%，比健康对照组［（1.56±0.95）%、（3.02± 1.15）%］明显升高（均P＜0.01）。Pearson相关性分析发现，CD3+HLA-DR+细胞百分比与银屑病皮损和严重程度评分指数（PASI）评分呈正相关（r＝0.5626，P＜0.05）。与健康对照组比较，寻常性银屑病患者皮损真皮中HLADR表达升高，但表皮中HLA-DR表达降低（均P＜0.05），HLA-DR在健康人主要分布在血管周围，而在寻常性银屑病患者则广泛表达于真皮组织。结论 寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞及皮损中的炎症细胞存在异常活化，外周血CD3+HLA-DR+细胞与疾病严重程度存在相关性。

银屑病；抗原，CD69；HLA-DR抗原；T淋巴细胞；淋巴细胞活化；疾病严重程度指数

银屑病是一种以T淋巴细胞异常活化和浸润为主要特征的慢性炎症性皮肤病，其病因尚不清楚，涉及遗传、免疫调节、环境及精神等多种因素［1］。其中，免疫失调和体内免疫状态的改变是银屑病反复发作和加重的关键，研究发现，在银屑病发病早期即有T淋巴细胞浸润皮损，银屑病患者外周血淋巴细胞亚群也发生了变化［2］。为了解皮损和外周血单一核细胞（PBMC）中免疫细胞的活化情况，我们采用流式细胞仪和免疫组化方法对寻常性银屑病患者PBMC和皮损组织中活化抗原CD69和HLADR的表达及分布情况进行检测，并分析其意义。

对象与方法

一、对象

1.血液标本：20例寻常性银屑病患者外周血标本取自同济大学附属第十人民医院皮肤科门诊，所有病例均符合寻常性银屑病的诊断标准。纳入标准：银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分≥10以及皮损面积＞10%体表面积的寻常性银屑病的患者；所有患者入组前1个月内未接受过系统治疗，2周内未外用银屑病治疗药物。排除标准：有严重感染和免疫抑制的患者；合并有肝、肾或其他严重疾病的患者；妊娠及哺乳期妇女。健康对照组20例，均为健康成人献血员。本研究通过同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准，所有患者和健康对照者均签署知情同意书。共入组寻常性银屑病患者20例，其中男12例，女8例，平均年龄51（28～82）岁，发病持续时间（6.2±6.5）年，PASI评分为17.8±7.4，其中3例患者有家族史。

2.组织标本：选取其中15例寻常性银屑病患者进行皮损组织病理检查，10例健康对照组的皮肤来自于整形外科手术腰背部正常皮肤，对皮肤组织病理切片进行免疫组织化学染色检测。

二、主要试剂

淋巴细胞分离液来自美国 MPbio公司；RPMI1640、二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清来自奥地利PAA Laboratories GmbH公司；佛波酯（PMA）和离子霉素来自美国Sigma-Aldrich公司。抗人CD 69异硫氰酸荧光素（FITC）、抗人CD3 APC-cy3（别藻蓝蛋白-3H吲哚菁型染料）、固定破膜液试剂盒（fixation&permeabilization kit）来自美国eBioscience公司；anti-HLA-DR抗体来自美国Abcam公司；羊抗兔 IgG来自美国 The Jackson Laboratory公司；Biosciences FACScantoII流式细胞仪来自美国BD公司；PV9000二步法免疫组织化学检测试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司。

三、方法

1.流式细胞仪检测CD3+CD69+和CD3+HLADR+细胞表达：采集所有受试者外周静脉血5 ml，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得外周血单一核细胞（PBMC）。用含2%胎牛血清的染色缓冲液将PBMC重悬、计数，将PBMC细胞浓度调整到1× 106个/ml，分别加入3个流式管中。试管1为同型对照；在试管2中加入anti-HLA-DR一抗孵育30 min，1 ml PBS洗涤2次，然后加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗和抗人CD3 APC-cy3室温孵育30 min；试管3中加入抗人CD3 APC-cy3和CD69 FITC室温孵育30 min。1 ml PBS洗涤2次，加入300 μl染色缓冲液立即上机检测。流式细胞仪检测结果采用flowjo6.5进行分析，圈定淋巴细胞门后，设定CD3+的T淋巴细胞门，分别分析CD3+CD69+和CD3+HLA-DR+淋巴细胞比率。

2.免疫组化检测HLA-DR在皮损的表达：采用免疫组化SP法。所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，经5 μm连续切片，常规脱蜡至水化，微波法抗原修复，3%过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，依次滴加正常山羊血清工作液（封闭）、一抗工作液、生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。采用PBS代替一抗为空白对照，以人淋巴组织做为阳性对照。阳性结果判定及Garcia半定量方法：细胞膜、胞质不着色或阳性细胞＜5%为阴性（-），细胞膜、胞质或细胞间隙呈黄色或阳性细胞在5%～25%之间为阳性（+），呈深黄色或阳性细胞在26%～75%之间为强阳性（++），呈棕黄色或阳性细胞＞75%为极强阳性（+++）。半定量法结果判定：在×400光镜下，随机选择10个视野，分别计数每视野表皮和真皮100个有核细胞中阳性细胞数。

3.统计学方法：采用SPSS19.0软件进行处理。计量资料以±s表示，两组间用t检验双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞中HLA-DR和CD69的表达

流式细胞仪检测发现，早期活化抗原CD69在寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞中的表达率明显高于其在健康对照组中的表达率［（4.70± 1.90）%，（1.56±0.95）%，t＝6.629，P＜0.01］，见图1。CD69在CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群的阳性百分比分别为（3.45±0.46）%、（3.50±0.55）%，明显高于健康对照组［（1.71±0.17）%、（2.11±0.41）%］，其中CD4+CD69+细胞百分比差异有统计学意义（t＝3.571，P＜0.01），而CD8+CD69+的T细胞百分比差异无统计学意义（t＝2.015，P＞0.05）。晚期活化抗原HLA-DR在寻常性银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞中的表达水平较健康对照组也显著增高［（8.97±1.79）%比（3.02±1.15）%，t＝6.204，P＜0.01］，见图1。

图1 流式细胞仪检测银屑病患者和健康对照外周血CD3+细胞中CD69（1A）和HLA-DR（1B）的表达 FITC为异硫氰酸荧光素，APC-cy3为别藻蓝蛋白-3H吲哚菁型染料

二、银屑病CD3+CD69+T淋巴细胞和CD3+HLADR+T淋巴细胞与PASI评分相关性分析

寻常性银屑病患者CD3+CD69+T淋巴细胞百分比与患者PASI评分不相关（r＝0.33，P＞0.05），而CD3+HLA-DR+T淋巴细胞百分比与患者PASI评分呈正相关（r＝0.56，P＜0.05）。

三、HLA-DR在寻常性银屑病和健康对照皮肤组织中的表达比较

寻常性银屑病组和健康对照组的皮肤中均有HLA-DR表达，但是HLA-DR在寻常性银屑病皮损组织中主要在真皮层大量炎症细胞浸润的部位有广泛表达，表皮层则仅有较少的表达。HLA-DR在健康对照皮肤组织中主要分布在真皮血管分布的区域，表皮中也有散在表达（图2）。HLA-DR半定量结果见表1，寻常性银屑病组皮损表皮层HLA-DR阳性细胞百分比为（11.80±5.55）%，比健康对照组（27.40±8.61）%明显降低，t＝5.479，P＜0.01。寻常性银屑病组真皮层HLA-DR的阳性细胞表达百分比为（64.87±17.31）%，较健康对照组（19.80± 5.69）%显著升高，t＝7.916，P＜0.01。

图2 银屑病患者皮损和健康对照组织HLA-DR免疫组化结果 银屑病患者（2A）表皮全层HLA-DR表达细胞较少，在基底层有少量表达，真皮浅层HLA-DR表达强阳性，细胞膜及细胞质染成深棕色（×400）。健康对照（2B）表皮HLA-DR有明显散在的阳性表达，真皮全层仅血管组织周围有强阳性（×400）。阴性对照组（2C）无深棕色的阳性表达（×200）

讨论

银屑病是一种在一定遗传背景下，效应T细胞介导的免疫紊乱性炎症性皮肤病［3-4］，活化的T细胞在银屑病的发生、发展中起重要作用［5-6］。近年研究发现，T淋巴细胞活化后表达多种表面分子，其中研究较多的活化抗原有CD69、CD25及HLA-DR等，这些分子的表达可作为T淋巴细胞活化的指标，已被广泛用于研究T淋巴细胞的功能［6］。

研究显示，3种激活相关抗原CD69、HLA-DR和CD25在T细胞受体激活后在特定时间表达而发挥免疫调节作用。CD69是淋巴细胞活化最早表达的膜表面分子，在丝裂原或抗原刺激下可迅速而短暂地表达于各种活化的淋巴细胞表面［7］，它可作为共刺激信号促进T细胞进一步活化和增殖。研究显示，甲氨蝶呤治疗银屑病可下调CD69的表达［8］。本研究结果显示，CD69在寻常性银屑病患者外周血CD3+T细胞和CD4+T细胞的表达相比健康对照显著升高，而在CD8+T细胞的表达无明显变化。Ferenczi等［6］对银屑病患者外周血和皮损的激活相关抗原和共刺激分子进行分析发现，CD69在银屑病皮损表皮表达明显升高而真皮仅轻度升高，同时HLA-DR和CD25在银屑病患者外周血T淋巴细胞中的表达也明显升高。研究显示，银屑病皮损中T淋巴细胞的浸润与疾病的反复发作及加重有关，提示T细胞的活化状态或许可以评估银屑病的疾病进展和临床治疗效果。我们在研究中发现，中重度斑块状银屑病患者外周血CD3+细胞中HLA-DR+细胞百分比与患者的PASI评分呈正相关，而CD69+细胞百分比与患者PASI评分无明显相关性，可以推测，在中重度银屑病患者中，晚期活化抗原HLA-DR的表达百分比与疾病的严重程度有关。

表1 寻常性银屑病患者和健康对照皮肤组织中HLA-DR免疫组化半定量结果（例）

本研究发现，寻常性银屑病患者外周血T细胞有较高水平的CD69表达，而在健康对照组中表达很低，提示在寻常性银屑病患者外周血中有较多处于激活状态的T细胞。Ferenczi等［6］发现银屑病患者局部皮损T淋巴细胞中CD69的表达几乎达到80%，而健康对照T细胞的CD69表达则很低。本研究中银屑病患者外周血CD3+T淋巴细胞表达CD69的百分比仅为（4.7±1.90）%，提示病变局部的T淋巴细胞处于更高水平的免疫活化状态。此外，对HLA-DR表达的研究显示在寻常性银屑病患者外周血T细胞中HLA-DR的表达明显高于健康对照，但是健康对照也有一定程度的HLA-DR表达，可能是正常存在的APC的表达。在银屑病局部皮损组织中，HLA-DR的表达主要分布在真皮组织中，而不是健康对照的表皮和血管周围，这种组织分布的差异也提示银屑病患者T细胞的免疫活化状态差异。HLA-DR抗原表达在APC（如朗格汉斯细胞、树突细胞和单核细胞等）上发挥抗原提呈作用［9］，在激活的T细胞和血管内皮细胞也有一定的表达［9-10］。免疫组化染色显示，HLA-DR在健康对照者主要表达在表皮以及真皮血管周围，这与表皮中存在朗格汉斯细胞有关；在银屑病皮肤组织中HLA-DR主要表达在真皮层的炎症细胞浸润的部位，而在表皮组织中的表达很少，可能是由于这些部位有大量的T细胞等炎症细胞浸润。

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Expressions of activation antigens CD69 and HLA-DR in peripheral blood mononuclear cells and skin lesions of patients with psoriasis vulgaris

Chen Wenjuan,Gu Junying,Gong Yu,Liu Zhiyu,Xu Hui,Xiong Huizi,Shi Yuling. Department of Dermatology,Shanghai Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Shi Yuling,Email:shiyuling1973@gongji.edu.cn

Shi Yuling,Email:shiyuling1973@gongji.edu.cn

ObjectiveTo investigate changes in expressions of activation antigens CD69 and HLA-DR in CD3+T lymphocytes in peripheral blood and skin lesions in patients with psoriasis vulgaris.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 20 patients with psoriasis vulgaris and 20 healthy controls,and skin specimens from the lesions of 15 out of the 20 patients and 10 healthy controls.Flow cytometry was performed to quantify the expressions of CD69 and HLA-DR in peripheral blood CD3+T cells,and an immunohistochemical study to measure the expression of HLA-DR in skin specimens.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test and Pearson correlation analysis with the SPSS 19.0 software.ResultsCompared with the healthy controls,the patients with psoriasis vulgaris showed increased expression rates of CD69（4.70%±1.90%vs.1.56%±0.95%,t＝6.629,P＜0.01）and HLA-DR（8.97%± 1.79%vs.3.02% ±1.15%,t＝6.204,P＜0.01）in peripheral blood.Pearson correlation analysis revealed that the percentage of CD3+HLA-DR+cells in peripheral blood was positively correlated with the psoriasis area and severity index（PASI）score（r＝0.5626,P＜0.05）.The expression rate of HLA-DR was significantly higher in the dermis（64.87%± 17.31%vs.19.80%±5.69%,t＝7.916,P＜0.01）,but lower in the epidermis（11.80%±5.55%vs.27.40%±8.61%,t＝5.479,P＜0.01）in the psoriatic specimens compared with the control specimens.Immunohistochemically,HLA-DR was widely expressed in the dermis of psoriatic lesions,but mainly distributed around blood vessels in the control skin.ConclusionsThere is an aberrant activation of CD3+T cells in peripheral blood and inflammatory cells in skin lesions in patients with psoriasis vulgaris,and the percentage of CD3+HLA-DR+cells in peripheral blood is correlated with the severity of psoriasis vulagaris.

Psoriasis;Antigens,CD69;HLA-DR antigens;T-lymphocytes;Lymphocyte activation;Severity of illness index

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.008

国家自然科学基金（81301356）；上海市自然科学基金（13ZR1432200）；上海市科委科研计划引导项目（134119b0700）

200072上海，同济大学附属第十人民医院皮肤科

史玉玲，Email：shiyuling1973@tongji.edu.cn

2014-12-31）

（本文编辑：尚淑贤）