单环刺螠糖胺聚糖抗凝血机制初步研究

崔青曼，刘　萍，王　悦，袁春营

（天津市海洋资源与化学重点实验室，天津科技大学海洋科学与工程学院，天津300457）

单环刺螠糖胺聚糖抗凝血机制初步研究

崔青曼，刘萍，王悦，袁春营

（天津市海洋资源与化学重点实验室，天津科技大学海洋科学与工程学院，天津300457）

采用人乏AT-Ⅲ血浆、乏HCII血浆及两种肝素辅因子均缺乏的血浆，探讨单环刺螠糖胺聚糖的抗凝血途径；通过纠正乏因子血浆所致的凝固时间延长的能力测定人血浆凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性，凝固法测定纤维蛋白原浓度；体外复钙凝血实验，研究糖胺聚糖对复钙凝血时间的影响；甲基百里酚蓝比色法测定大鼠和小鼠血清中钙离子浓度。结果表明：单环刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依赖性，并能够钝化肝素辅因子Ⅱ抑制凝血酶的活性；单环刺螠糖胺聚糖显著降低血浆凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05）；糖胺聚糖可通过屏蔽血液中Ca2+，延长大鼠血复钙凝血时间，极显著降低大鼠和小鼠血液中的钙离子浓度（p＜0.01），且其降低血液钙离子浓度的作用极显著优于肝素钠（p＜0.01）。

单环刺螠，糖胺聚糖，抗凝血机制

糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）又称氨基多糖，是由氨基己糖和己糖醛酸交替结合而形成的长链分子，广泛存在于动物体内，是蛋白多糖的糖链部分，具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、降血糖等广泛的生物学功能［1-6］。单环刺螠（Urechis unicinctus），俗名海肠子，属于螠虫动物门（Echiurioidea）、螠纲（Echiurida）、无管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae），是一种长圆筒形软体动物，分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国渤海湾等，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。前期研究表明，单环刺螠糖胺聚糖具有较好的抗凝血作用［7］，为此，本研究从肝素辅因子、凝血因子和钙离子等多个方面，探讨该糖胺聚糖的抗凝血作用机制，为单环刺螠糖胺聚糖进一步的开发利用提供良好的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

单环刺螠糖胺聚糖天津科技大学应用海洋生物研究室提取纯化，相对分子质量450.032ku，硫酸根含量为30.26%，糖醛酸含量为25.25%，氨基糖含量为7.58%［7］；人凝血酶（TT）时间诊断试剂盒、凝血酶原（PT）时间诊断试剂盒、活化部分凝血活酶（APTT）时间诊断试剂盒、纤维蛋白原（FIB）测定试剂、标准血浆、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性测定试剂盒（凝固法）、乏抗凝血酶-Ⅲ血浆、乏肝素辅因子II血浆和两种肝素辅因子均缺乏的血浆德国Siemens Healthcare Diagnostics Inc.；肝素钠效价：≥140U/mg，Cat.No.H8060，北京索莱宝科技有限公司；Wister大鼠

SPF级，体重（163.88±4.51）g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，批号SCXK-（军）2012-0004；Km小鼠SPF级，体重（23.58±1.43）g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，批号SCXK-（军）2012-0004。

Allegra X-15R台式冷冻离心机美国贝克曼库尔特有限公司；CA-7000全自动凝血分析仪日本希森美康株式会社；TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1糖胺聚糖对抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）及肝素辅因子Ⅱ（HC-Ⅱ）抑制凝血酶作用的影响标准血浆、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及两种肝素辅因子均缺乏的血浆中分别加入糖胺聚糖（1∶10），对照组加入等体积生理盐水，糖胺聚糖浓度4mg/mL，预温5min后加入预温15min的PT和TT试剂，用凝血因子分析仪测定凝固时间。

1.2.2糖胺聚糖对血浆凝血因子活性的影响糖胺聚糖设置三个浓度梯度，即50、100、200μg/mL，阳性对照肝素钠浓度50μg/mL，空白对照组为同体积生理盐水。按照凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ测定试剂盒说明书测定其活性，凝固法测定纤维蛋白原浓度。

1.2.3糖胺聚糖对大鼠血体外复钙凝血时间的影响

采用10mg/mL和3mg/mL两种不同质量浓度钙离子，糖胺聚糖浓度分别为1、2、4mg/mL，生理盐水作为空白对照，肝素钠作为阳性对照。大鼠股动脉取血，制备抗凝血（5mL血液中加入0.1mL 5%草酸钾溶液）。0.9mL血液中加入0.1mL不同浓度糖胺聚糖，空白对照组和阳性对照组分别加入等体积生理盐水和肝素钠（1mg/mL），然后加入不同浓度的的氯化钙溶液0.1mL，37℃恒温水浴，每隔30s将试管轻轻倾斜一次，当血液在离心管中不再流动时，记录下时间，以秒表示。

1.2.4糖胺聚糖对大鼠血液中钙离子浓度的影响选择雌雄大鼠36只，随机分为6组，正常喂养3d后尾静脉注射糖胺聚糖（1、4、16mg/kg）、肝素钠（4mg/kg）和生理盐水，注射量0.5mL，30min后股动脉采血，3000r/min离心15min，取上清液，甲基百里酚蓝比色法测定血清中的钙离子浓度［8］。

1.2.5糖胺聚糖对小鼠眼眶后静脉丛血液中钙离子浓度的影响分别用1、2、4mg/mL糖胺聚糖、2mg/mL肝素钠（阳性对照）和生理盐水（空白对照）浸泡毛细吸管24h，烘干备用。60只小鼠随机分为6组，每组10只，用处理过的毛细管对小鼠进行眼眶后静脉丛取血0.12mL，置于塑料离心管中，3000r/min离心10min，测定方法同1.2.4。

1.3数据处理

所有实验数据均采用单因素方差分析。分析软件为SPSS 17.0，实验数据均以mean±SD表示。

2　结果与分析

2.1糖胺聚糖抗凝血酶活性对抗凝血酶（AT）Ⅲ和肝素辅因子（HC）Ⅱ的依赖关系

标准血浆、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及两种肝素辅因子均缺乏的血浆中糖胺聚糖对血液PT和TT的作用结果见表1，从表1看出，标准血浆、乏ATⅢ血浆、乏HC-Ⅱ的血浆、两种因子均缺乏的血浆中加入糖胺聚糖后，TT均极显著延长（p＜0.01），除了标准血浆加入糖胺聚糖后PT显著延长（p＜0.05）外，其他PT均极显著延长（p＜0.01）。与标准血浆加GAG组比较，乏AT-Ⅲ血浆中加入糖胺聚糖后，TT极显著缩短（p＜0.01），PT极显著延长（p＜0.01），两种肝素辅因子均缺乏的血浆中加入糖胺聚糖后，TT显著缩短（p＜0.05），乏HC-Ⅱ的血浆中加入糖胺聚糖后PT极显著延长（p＜0.01），明显延长TT。推测存在着不同于肝素的抗凝血途径。

马西等［9］报道剌参酸性粘多糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依赖性，也有资料显示其抗凝血酶作用主要呈HC-Ⅱ依赖性［10-11］。本研究发现在标准血浆中加入糖胺聚糖后，TT极显著延长（p＜0.01），PT显著延长（p＜0.05），乏HC-Ⅱ血浆中加入糖胺聚糖后，TT和PT均极显著延长（p＜0.01），与标准血浆加入糖胺聚糖比较，乏AT-Ⅲ血浆中加入糖胺聚糖后TT和PT均极显著缩短（p＜0.01），推测单环刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依赖性。此外，还发现糖胺聚糖可能具有钝化肝素辅因子Ⅱ抑制凝血酶活性的作用，因为与标准血浆加入糖胺聚糖比较，乏HC-Ⅱ血浆中加入糖胺聚糖后TT明显延长，PT极显著延长（p＜0.01）。

表1　糖胺聚糖抗凝血酶活性对抗凝血酶Ⅲ和肝素辅因子（HC）Ⅱ的依赖关系（n=6）Table 1　Effect of glycosaminoglycan on the function of AT-Ⅲand HC-Ⅱinhibiting thrombin activity（n=6）

2.2糖胺聚糖对血浆凝血因子活性的影响

通过纠正乏因子血浆所致的凝固时间延长的能力来测定凝血因子活性。结果见表2，从表2看出，肝素钠组血浆纤维蛋白原（FIB）含量明显低于对照组，但未达显著水平（p＞0.05），不同浓度的糖胺聚糖组FIB含量与对照组相比没有明显差异；肝素钠、糖胺聚糖能够极显著降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ的活性（p＜0.01），肝素钠和中高浓度的糖胺聚糖能够极显著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.01），低浓度的糖胺聚糖能够显著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.05）；且相同浓度下，糖胺聚糖降低凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ活性的能力极显著低于肝素钠（p＜0.01），降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ活性的能力明显低于肝素钠，降低凝血因子Ⅹ、Ⅷ活性的能力略微高于肝素钠。

肝素能够与AT结合，催化灭活凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa和Ⅻa，肝素激活肝素辅因子Ⅱ而直接灭活凝血因子Ⅱa，这是肝素抗凝作用的主要机制［12］。本研究发现，单环刺螠糖胺聚糖显著降低血浆凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05，p＜0.01），推测由于糖胺聚糖与抗凝血酶Ⅲ结合，引起AT-Ⅲ构象的改变，使AT-Ⅲ的精氨酸残基更易与凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的丝氨酸残基结合，从而灭活或抑制这些凝血因子的活性。糖胺聚糖显著降低血浆凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性的原因可能是该糖胺聚糖与这两种大分子糖蛋白中的氨基酸结合，直接抑制两种因子的活性。糖胺聚糖降低血浆凝血因子Ⅱ的作用较小，推测是糖胺聚糖对肝素辅因子Ⅱ的钝化作用所致。

2.3糖胺聚糖对大鼠血体外复钙凝血时间的影响

实验结果见表3。与对照组相比较，肝素钠中加入3mg/mL和10mg/mL氯化钙后，能极显著延长凝血时间（p＜0.01），中高浓度糖胺聚糖中加入3mg/mL氯化钙后，均能显著延长凝血时间（p＜0.05），糖胺聚糖中加入10mg/mL氯化钙后，明显延长凝血时间，但未达显著性水平（p＞0.05）。10mg/mL氯化钙组与3mg/mL氯化钙组相比较，对照组、肝素钠和糖胺聚糖均极显著缩短了凝血时间（p＜0.01）。

表2　糖胺聚糖对血浆凝血因子的影响（n=6）Table 2　Effect of glycosaminoglycan on coagulation factor activities in plasma（n=6）

Ca2+是血液中极其重要的活性离子，作为凝血因子Ⅳ在凝血过程中发挥极其重要的作用［13］。单环刺螠糖胺聚糖是一类富含硫酸基团的聚阴离子多糖，对K+、Na+、Ca2+、Mg2+等具有较大的亲和力［7］。本研究证实，该糖胺聚糖可通过屏蔽血液中Ca2+，延长大鼠血复钙凝血时间。

表3　糖胺聚糖对大鼠体外复钙凝血时间的影响（s，n=6）Table 3　Effect of glycosaminoglycan on blood recalcification time of rats in vitro（s，n=6）

表4　糖胺聚糖对大鼠血液中钙离子浓度影响（n=6）Table 4　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration in rats blood（n=6）

2.4糖胺聚糖对大鼠血液中钙离子浓度的影响

大鼠血液中钙离子浓度测定结果见表4，从表4看出，大鼠尾静脉注射单环刺螠糖胺聚糖后，血液中钙离子浓度极显著降低（p＜0.01），且存在着浓度依赖关系，肝素钠组大鼠血液中钙离子浓度明显低于对照组，但未达显著水平（p＞0.05），中高浓度糖胺聚糖组大鼠血液中钙离子浓度极显著低于肝素钠组（p＜0.01）；此外还发现，单环刺螠糖胺聚糖降低血液钙离子浓度的强度极显著高于肝素钠（p＜0.01），可能是由于糖胺聚糖的硫酸根含量较高的缘故［7］。

2.5糖胺聚糖对小鼠眼眶后静脉丛取血过程中血液钙离子浓度的影响

实验结果见表5，从表5看出，不同浓度单环刺螠糖胺聚糖和肝素钠均能极显著降低小鼠血液中钙离子浓度（p＜0.01），与朱伟等［13］的研究结果相一致。Goto等［14］曾给犬股动脉灌注肝素，发现血液钙离子水平下降，且呈剂量依赖型。此外，发现不同浓度糖胺聚糖组小鼠血液中钙离子浓度极显著低于肝素钠组钙离子浓度（p＜0.01），说明单环刺螠糖胺聚糖对小鼠血液中钙离子浓度的影响明显大于肝素钠。

表5　糖胺聚糖对小鼠眼眶后静脉丛血液中钙离子浓度的影响（n=10）Table 5　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration during blood collectin from posterior orbital venous plexus in mice（n=10）

3　结论

单环刺螠糖胺聚糖抗凝血的可能机制是：糖胺聚糖通过与抗凝血酶Ⅲ结合，抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性，直接抑制凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活性，降低血浆中钙离子浓度，抑制内源性和外源性凝血系统功能，从而完成抗凝血作用。

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Preliminary study on the anticoagulation mechanism of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus

CUI Qing-man，LIU Ping，WANG Yue，YUAN Chun-ying
（Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry，College of Marine Science&Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In this paper，the anticoagulation approaches of glycosaminoglycan was studied with AT-III-deficient plasma，HC-II-deficient plasma and both factor-deficient plasma in human.The activities of coagulation factor II，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII and the fibrinogen content in human plasma were measured using the solidification method.The influence of glycosaminogly could on blood recalcification time in rats was studied by using recalcification experiment.The Ca2+concentrations in rats and mice serum were measured through methyl thymol blue colorimetric method.The results showed that the antithrombin role of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus mainly presented AT-Ⅲ dependency.Glycosaminoglycan could passivate the thrombin inhibitory activity of heparin cofactor II.Glycosaminoglycan significantly reduced the activities of coagulation factor V，VII，X，VIII，IX，XI，XII in the plasma（p＜0.05）.Besides，glycosaminoglycan could extend prolong recalcification time in rats by shielding Ca2+in plasma，and significantly reduced Ca2+concentration in rats and mice serum（p＜0.01）.Glycosaminoglycan reduced the Ca2+concentration in a more intensive way than that of heparin sodium（p＜0.01）.

Urechis unicinctus；glycosaminoglycan；anticoagulation mechanism

TS254.9

A

1002-0306（2015）12-0337-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.063

2014－10－20

崔青曼（1964-），女，博士，教授，主要从事海洋生物资源开发利用技术方面的研究。

天津市自然科学基金重点项目（13JCZDJC29600）。