苹果果胶酯酶提取及其酶学性质探究

张　卉，张　妍，张　璇，王　丹

（沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁沈阳110142）

苹果果胶酯酶提取及其酶学性质探究

张卉，张妍，张璇，王丹

（沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁沈阳110142）

以国光苹果为原料，通过单因素和正交实验考察了NaCl浓度、pH、提取温度和提取时间对苹果果胶酯酶酶活的影响，确定了苹果果胶酯酶最佳提取工艺参数，并研究了苹果果胶酯酶的酶学性质。结果表明：在NaCl浓度为2.5mol/L、pH为8.5、提取温度30℃和提取时间为27h时，苹果果胶酯酶的酶活达到0.98μmol/min·mL；该酶反应的最适温度为40℃，热稳定性较差，最适pH为11；金属离子中Ca2+对果胶酯酶有显著的激活作用，Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，而Ba2+、Mn2+和EDTA对果胶酯酶有抑制作用。

果胶酯酶，提取条件，酶学性质，苹果

果胶酯酶（pectinesterase，EC.3.1.1.11）是果胶酶的一种，广泛存在于植物组织和微生物体内。在苹果深加工中，果胶酯酶可以催化苹果果胶（高甲氧基果胶）脱去甲氧基，进一步与苹果中存在的二价离子如钙离子结合，形成果胶酸钙凝胶和甲醇，引起苹果汁的浑浊和苹果酒甲醇含量提高［1-5］，从而对苹果深加工产品的品质和安全性产生严重影响。目前酿酒工业上解决果酒甲醇含量问题主要采用发酵后蒸馏环节脱甲醇和发酵前加热灭酶的方法，但是蒸馏环节脱甲醇一直不能达到良好的效果，加热灭酶会损失风味物质，严重影响果酒的质量；而从商品果胶酶中将果胶酯酶分离，除去因成本过高在生产上也是不可行的；因此，对苹果酒生产中内源果胶酯酶的性质及其催化果胶分解生成甲醇的机理，以及果胶酯酶抑制剂对其活性调控的研究具有重要的理论意义，对我国苹果深加工产业具有实际应用价值。此外，在茶饮料等食品加工和造纸等生产工艺中也广泛利用果胶酯酶来改善产品品质。但目前国内外大部分研究集中于真菌和细菌来源的果胶酯酶，对苹果等植物内源果胶酯酶的研究报道甚少［6-8］。根据已有报道可知，大部分果胶酯酶的本质是蛋白质，所以影响蛋白质提取的因素，如盐离子浓度、温度、pH等，在果胶酯酶的提取中也是必要的考察因素［9-10］。

本文以国光苹果为原料，探索了苹果果胶酯酶提取的影响因素和苹果果胶酯酶的酶学性质，为苹果果胶酯酶结构和功能关系研究，以及果酒生产中甲醇含量的控制和苹果浊汁脱稳等食品加工问题奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

苹果为东北地区种植面积广、产量大的国光苹果，购买自沈阳市宁官市场，袋装后置于冰箱中-20℃冷冻保存备用；果胶Sigma；其余试剂均为国产分析纯。

BS124S型电子天平北京赛多利斯科学仪器有限公司；HR（87）型匀浆机飞利浦电子香港有限公司；ZDJ-4A型自动电位滴定仪上海仪电科学仪器股份有限公司；CT15RT型高速冷冻离心机上海驭诺实业有限公司；BCD-215KS型立式海尔电冰箱青岛海尔股份有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅上海国华电器有限公司；79-1型磁力搅拌器常州国华电器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1苹果果胶酯酶的提取将苹果在4℃解冻24h后，去皮、核，果肉与NaCl溶液按照料液比1∶1混合后匀浆，匀浆在不同浓度NaCl、pH、温度和时间条件下处理后经纱布过滤，然后在15000r/min，4℃条件下离心30min，取上清液即为粗酶液。

1.2.2果胶酯酶酶活的测定采用pH-stat法测量苹果果胶酯酶酶活［11］。取18mL去离子水、2mL 0.1mol/L的NaCl溶液、10mL的1%（w/v）果胶溶液混合，在35℃恒温条件下加入1mL粗酶液，用0.05mol/L NaOH溶液和HCl溶液调节溶液的pH至7.5，开始计时。利用自动滴定仪不断加入0.01mol/L NaOH溶液，使反应体系的pH始终保持在7.5。滴定开始后，每2min记录一次消耗NaOH溶液的总体积，以消耗的NaOH溶液的总体积-反应时间作图，由所得直线的初始斜率计算果胶酯酶的酶活。酶活用每分钟生成酸的微摩尔数表示，即酶活单位为μmol/min·mL。

1.2.3苹果果胶酯酶提取参数的优化

1.2.3.1单因素实验设计在提取温度为30℃，溶液pH为8，提取时间为12h时，设定NaCl浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mol/L）；在NaCl浓度2.0mol/L，pH为8，提取时间为12h时，设定温度（5、10、15、20、25、30、35℃）；在NaCl浓度2.0mol/L，提取温度为30℃，提取时间为12h时，设定pH（5、6、7、8、9、10）；在NaCl浓度2.0mol/L，提取温度为30℃，pH为8时，设定提取时间（0、6、12、18、24、30、36h）。研究各个因素对苹果果胶酯酶提取的影响。所有的实验均做3次重复。

1.2.3.2正交实验设计选择NaCl浓度、pH、提取温度和提取时间4个因素为研究对象，以苹果果胶酯酶酶活为评判指标，选用L9（34）正交表进行实验优化方案设计，正交实验因素与水平设计表见表1。

表1　L9（34）正交实验因素水平设计表Table 1　The factors and levels for the L9（34）orthogonal design

1.3苹果果胶酯酶酶学性质研究

1.3.1温度对苹果果胶酯酶的影响取1mL粗酶液分别在20、25、30、35、40、45、50、55℃条件下测定酶活，用果胶酯酶酶活对温度作图，酶活最大值对应的温度即为该酶的最适作用温度。实验重复3次。

1.3.2pH对苹果果胶酯酶的影响在最适作用温度条件下，分别用不同pH（5.0～12.0）的缓冲液配制1%的果胶溶液，测定不同pH条件下果胶酯酶的酶活，用果胶酯酶酶活对pH作图，酶活最大值对应的pH即为该酶的最适作用pH。实验重复3次。

1.3.3苹果果胶酯酶的热稳定性将果胶酯酶酶液分别置于10、20、30、40、50、60℃条件下保温1h后，用最适pH的缓冲溶液配制1%（w/v）的果胶溶液，在最适温度和最适pH条件下测定其酶活。以最高酶活值为100%，其他条件下所得的酶活以此为标准计算出相对酶活，用相对酶活对温度作图。实验重复3次。

1.3.4苹果果胶酯酶的酸碱稳定性各取3mL果胶酯酶酶液分别加到9mL pH为5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲溶液中，40℃放置1h，分别在最适温度和最适pH条件下测定酶活，以最高酶活值为100%，其他条件下所得的酶活以此为标准计算出相对酶活，用相对酶活对时间作图。实验重复3次。

1.3.5金属离子对苹果果胶酯酶的影响在酶液中分别添加NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、BaCl2、MnSO4和EDTA的水溶液，使各金属离子和EDTA的终浓度为2mmol/L［12］，在室温下静置30min后，用最适pH的缓冲溶液配制1%的果胶溶液（w/v），在最适温度条件下测定其酶活。以未加金属离子的酶活值为100%，其他条件下所得的酶活以此为标准计算出相对酶活，用相对酶活对金属离子作图。实验重复3次。

2　结果与分析

2.1提取因素对苹果果胶酯酶酶活的影响

2.1.1NaCl浓度对苹果果胶酯酶酶活的影响在溶液pH为8，提取温度为30℃、提取时间12h条件下，不同NaCl浓度对苹果果胶酯酶酶活的影响结果如图1所示。由图1可以看出，随着NaCl浓度的增加，粗酶液中苹果果胶酯酶的酶活基本呈直线关系上升，当NaCl浓度为2mol/L时达到最高值，后随着浓度增加开始急剧下降。可能是因为低浓度的Na+有助于蛋白质的溶解，使得溶液中的酶量增加，溶液的酶活增大，但是当Na+浓度过高时，果胶酯酶开始逐渐被盐析出来，导致溶液中酶量变小，酶活降低。故提取苹果果胶酯酶的NaCl浓度选为2mol/L。

图1　NaCl浓度对苹果果胶酯酶酶活的影响Fig.1　Effect of NaCl concentration on PE activity extracted from apple

2.1.2提取温度对苹果果胶酯酶酶活的影响在NaCl浓度为2mol/L，pH为8，提取时间为12h条件下，不同温度对提取苹果果胶酯酶酶活的影响结果如图2所示。由图2可以看出，在5～15℃时，果胶酯酶的酶活变化不大，15～30℃时，随着温度的增加，粗酶液中苹果果胶酯酶的酶活呈增长趋势，超过30℃以后随着温度增加开始呈下降趋势。可见温度对果胶酯酶的提取影响较大，原因可能与酶的最适作用温度有关，低温条件下，酶没有完全被释放到溶液中，导致溶液的酶活性较低。因此，最适提取温度选用30℃。

图2　提取温度对苹果果胶酯酶酶活的影响Fig.2　Effect of temperature on PE activity extracted from apple

2.1.3pH对苹果中果胶酯酶酶活影响在NaCl浓度为2mol/L、温度为30℃、提取时间12h条件下，不同pH对苹果果胶酯酶提取酶活的影响结果如图3所示。由图3可知，pH≤7时，果胶酯酶的酶活随着pH的升高缓慢增加，pH超过7以后果胶酯酶的酶活随着pH的增大迅速变大，到pH为8时达到最大值，pH≥8时，又开始逐渐下降。根据实验结果，pH超过9，溶液中开始有少量沉淀析出，根据Jean-Marc Denes等［15］从cv Golden Delicious apple中提取的果胶酯酶等电点是高于9的，所以pH超过9以后，可能逐渐接近其等电点，开始有少量蛋白酶析出，导致酶活下降［10］。所以，提取果胶酯酶的最适pH为8。

图3　pH对苹果果胶酯酶酶活的影响Fig.3　Effect of pH value on PE activity extracted from apple

2.1.4提取时间对苹果中果胶酯酶活力影响在NaCl浓度为2mol/L，pH为8，温度30℃条件下，不同提取时间对苹果果胶酯酶酶活力的影响结果如图4所示。由图4可以看出，在提取时间为0～24h时，苹果果胶酯酶活性随着提取时间的增加而增大，到达24h时基本已经完全浸出，之后酶活性略有降低，考虑到提取时间过长对实验操作带来不便和酶液变质问题［13］，因此，选择提取时间为24h。

图4　提取时间对苹果果胶酯酶酶活的影响Fig.4　Effect of extraction time on PE activity extracted from apple

2.2苹果果胶酯酶提取条件的优化结果

正交实验优化苹果果胶酯酶提取的结果见表2。

表2　正交实验结果Table 2　Results of orthogonal experiment

由表2的极差分析可以看出，影响果胶酯酶酶活大小的因素主次顺序为B＞D＞A＞C，即提取温度＞提取时间＞NaCl浓度＞pH。苹果果胶酯酶提取的最优组合为A3B2C3D3，即最佳的提取条件为NaCl浓度2.5mol/L，pH为8.5，提取温度30℃，提取时间为27h。

方差分析结果（见表3）表明提取温度对提取苹果果胶酯酶酶活有显著性影响。

表3　正交实验方差分析表Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment

由于最佳组合不在正交实验设计表中，因此要进一步进行验证最佳工艺条件的可靠性。准确称取3份100g苹果，分别按照最优条件（A3B2C3D3）进行验证实验。测得的果胶酯酶酶活的平均值为0.98μmol/min·mL，表明该工艺条件比较稳定，可以作为提取苹果果胶酯酶的最佳工艺条件。

2.3苹果果胶酯酶酶学性质

2.3.1苹果果胶酯酶最适作用温度由图5可知，苹果果胶酯酶酶活在20～40℃时随温度的增加而增加，40℃达到最大值，40～55℃呈下降趋势。其中温度为在30～45℃之间时酶活较高，达到65%以上，超过55℃以后酶活仅剩10%左右。因此，该酶的最适反应温度为40℃。这与已有关于植物源果胶酯酶的报道相比偏低，例如张敬民研究的向日葵花盘中果胶酯酶的最适作用温度为45℃［6］，而孙君梅等从番茄果胶酯酶最适作用温度达到60℃［14］。

图5　温度对果胶酯酶酶活的影响Fig.5　Effect of temperature on PE activity

2.3.2苹果果胶酯酶最适作用pH由6可知，苹果果胶酯酶在酸性条件下酶活较低，pH在8～10时增长缓慢，当pH大于10时酶活开始迅速上升，pH达到11时，酶活达到最高值，之后开始迅速下降，当pH到达12时酶活降低为0。因此，该酶为碱性酶，最适反应pH为11。有关碱性果胶酯酶的报道较少，已有的报道如Jean-Marc Denes等［15］利用抑制剂从cv Golden Delicious apple中提取的果胶酯酶的最适作用pH为7.5；Ozler等［16］从Malatya apricot中得到的果胶酯酶最适pH为9；Karen King［17］从Bramley apple中得到的果胶酯酶的最适pH为10。而本实验从国光苹果中得到的果胶酯酶最适pH为11，从相关的研究和报道来看，尚未发现有碱性与之吻合的果胶酯酶，其碱性较高的原因和应用方向有待进一步研究。

2.3.3苹果果胶酯酶热稳定性由图7可知，苹果果胶酯酶的热稳定性较差，在低于20℃条件下保温1h后较稳定，相对酶活能保持80%以上，20℃以后相对酶活开始降低，而在超过50℃时保温1h以后果胶酯酶活性全部丧失。

图6　pH对果胶酯酶酶活的影响Fig.6　Effect of pH value on PE activity

图7　果胶酯酶的热稳定性Fig.7　Temperature stability of PE

2.3.4苹果果胶酯酶的pH稳定性苹果果胶酯酶的酸碱稳定性如图8所示。由图8可以看出，该酶在pH＜7时稳定性较差，pH为8～11范围内比较稳定，处理1h以后相对酶活仍然保持在80%以上，而pH超过12以后相对酶活仅为12.1%。因此该酶的pH稳定性在8～11的碱性范围内。

图8　果胶酯酶的pH稳定性Fig.8　pH stability of PE

2.3.5金属离子对苹果果胶酯酶酶活的影响金属离子和EDTA对苹果果胶酯酶的影响结果见图9。由图9可以看出，Ca2+对果胶酯酶有明显的激活作用；Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，但效果不明显；Ba2+、Mn2+和EDTA对果胶酯酶有抑制作用，其中EDTA有明显的抑制作用，说明该酶为金属酶。在实验中发现，反应体系中若含有较高浓度的Ca2+，则Ca2+在加热的条件下会与其中游离的半乳糖醛酸结合生成不溶性沉淀，进而影响酶促反应的进行。因此选用对果胶酯酶激活作用相对较强的NaCl溶液作为提取剂。

3　结论

综合考虑了NaCl浓度、pH、提取温度和提取时间四个影响因素，得到苹果果胶酯酶提取的最优工艺条件：NaCl浓度2.5mol/L、pH为8.5、提取温度30℃、提取时间27h。苹果果胶酯酶的最适反应温度为40℃，温度稳定性较差，超过50℃保温1h后活性全部丧失；最适作用pH为11，pH稳定范围为8～11，在pH8～11条件下放置1h以后相对酶活仍然保持在80%以上，为强碱性酶；Ca2+对果胶酯酶有明显的激活作用，Na+、K+和Fe2+也有一定的激活作用，Ba2+、Mn2+和EDTA对果胶酯酶有抑制作用，其中EDTA有明显的抑制作用。

本研究初步探究了苹果果胶酯酶酶学性质，有望为苹果果酒生产中甲醇含量的控制问题提供理论基础。但其具体的果胶酯酶催化反应机理还需要进一步对其分离纯化之后进行研究。

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Extraction and enzyme properties of pectinesterase from apple

ZHANG Hui，ZHANG Yan，ZHANG Xuan，WANG Dan
（College of Pharmaceutical&Biology Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142，China）

The optimal extraction condition of pectinesterase from apple was studied.Through single factor and orthogonal experiment，NaCl solution concentration，pH，extraction temperature and time were investigated，and the enzyme properties from apple were also studied in this article.The results showed that：under the conditions of NaCl solution concentration 2.5mol/L，pH8.5，extraction temperature 30℃，extraction time 27h，pectinesterase activity could reach 0.98μmol/min·mL.The optimal temperature and pH of pectinesterase was 40℃ and 11，respectively.Its temperature stability was poor.Metal ions such as Na+，Ca2+，K+，Fe2+could stimulate pectinesterase activity，especially Ca2+was more remarkable stimulation than others.Ba2+，Mn2+and EDTA were inhibitors of pectinesterase activity.

pectinesterase；extraction condition；enzyme property；apple

TS201.2+5

A

1002-0306（2015）12-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.033

2014－10－31

张卉（1968-），女，博士，副教授，主要从事食品生物技术、生物活性物质构效关系的研究。

辽宁省科技厅科技基金（2013020060）。