鱼类体表粘液抗菌肽的研究进展

李婷婷，张慧芳，晋高伟，姜　杨，励建荣，*

（1.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600；2.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

鱼类体表粘液抗菌肽的研究进展

李婷婷1，张慧芳2，晋高伟2，姜杨2，励建荣2，*

（1.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600；2.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

鱼类体表粘液中的抗菌肽是对细菌起直接抑制作用的一类重要物质，是鱼体天然免疫的重要组成部分，它具有抗细菌、真菌、病毒和肿瘤作用，且不易产生抗药性，具有广阔的应用前景。本文综述了鱼类体表粘液抗菌肽的抑菌活性、分离纯化、基因工程、作用机理及其在食品方面的应用前景。

鱼类体表粘液抗菌肽，抑菌活性，抑菌机制，应用前景

鱼类的皮肤与水环境直接接触，皮肤上覆盖着一层由上皮细胞和表皮杯状细胞分泌的粘液，作为鱼类第一道免疫防线，具有渗透压调节器、天然润滑剂、鱼类种内化学信息传递介质等多种重要的生理作用。此外，鱼类体表粘液还具有免疫学功能［1-2］。近十多年来，对鱼类粘液成分的研究已经取得了一定的进展，例如，对细菌起间接抑制作用的补体、干扰素，对细菌起直接抑制作用的凝集素、溶菌酶，非特异性免疫因子和抗菌肽的成分、分子结构、功能等方面［3-5］，其中鱼类体表粘液中的抗菌肽是对细菌起直接抑制作用的重要物质。鱼类体表粘液抗菌肽分子量一般在2～10ku之间，多为两亲性分子属于阳离子肽，pI大多大于10，其结构与组成复杂多样［6-8］。迄今为止，已分离纯化了几种鱼类体表粘液抗菌肽。分析已报道的鱼类体表粘液抗菌肽氨基酸序列，它们的同源性并不是很高，但结构上存在一定的共同特征，如含有较多使分子带正电的精氨酸或赖氨酸；含有较多可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构的疏水氨基酸等［9-10］。它们的抗菌作用机制相近，但对于不同鱼类，其分子结构和作用机制的差异比较大。本文就鱼类表皮粘液抗菌肽的抑菌活性、分离纯化、基因工程、抑菌机制和应用前景等方面进行综述。

1　鱼类体表粘液抗菌肽的抗菌活性

国外已经对一些鱼类抗菌肽的抗菌活性进行了一些研究，主要涉及人和动物的一些常见菌、水产养殖中常见的鱼类致病菌和腐败菌等，最小抑菌浓度多在毫摩尔水平（表1）。人和动物常见菌有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、绿色气球菌（Aerococcus viridans）、柠檬色运动球菌（Planococcus citreus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typ himurium）；水产养殖中常见鱼类致病菌：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、嗜水汽单胞菌（Aeromonas hydrophila）、鲑肾杆菌（Renibacterium salmoninarum）、杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、鳗弧菌（Vibrio anguillarium）；真菌：白色念珠球菌（Canidia albicans）、啤酒酵母菌（Saccharom ycescerevisiae）、光滑假丝酵母（Candida glabrata）、葡萄假丝酵母（Candida lusitania）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、新型隐球菌（Cryptococcus Neoformans）。Austin&McIntosh［11］早在1988年就报道了虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）体表粘液具有较好的抗菌特性。Kanno［12］、Fouz等［13］发现将香鱼（Plecoglossus altivelis）和大菱鲆（Scophthalmus maximus）的表皮粘液去除后会导致其迅速死亡。Lemaître等［14］研究表明鲤鱼（Cyprinus carpio）体表粘液去除后易遭受细菌的侵染从而导致其迅速腐败。Claire Hellio等［15］用水、乙醇和三氯甲烷分别提取13种鱼类的鱼皮和体表粘液，共78种提取物，15种被检出有抑菌活性，其中三分之一为皮肤提取物，其余为皮肤粘液提取物。Subramanian［16］、Hellio等［17］报道了红点鲑鱼（Salvelinus alpinus）、河鳟鱼（S.fontinalis）、鲤鱼（Cyprinus carpio sub sp.Koi）、条斑鲈鱼（Morone saxatilis）、鳕鱼（Melanogrammus aeglefinus）、八目鳗鱼（Myxine glutinosa）等多种鱼的体表粘液具有较广的抗菌活性。同时，许多学者对鱼表皮粘液的抗菌成分进行了深入研究，Kitani等［18］分离到岩鱼（S.schlegeli）体表的抗菌蛋白SSAP，研究了其分子结构及抗菌机理，发现SSAP抗菌肽具有广谱抗菌性，可以同时抑制G+以及G-细菌。Takahashi［19］、Smith［20］从黄鳍短须石首鱼（Seriola quinqueradiata）、鲤鱼（carpio）及虹鳟鱼（O.mykiss）的体表粘液中提取的抗菌肽对巴斯德氏菌属（Pasteurella piscicida）、鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）、胞壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）等均具有明显的抑制效应。有些抗菌肽对真菌也有抑制效果，如美洲拟鲽（Pleuronectes americanus）体表分泌的具有25个氨基酸残基的抗菌肽Pleurocidin，可抑制真菌生长［21］。大多抗菌肽没有溶血活性，Jung-Kil Seo［22］从金枪鱼（Thunnus albacares）皮肤中分离出一种抗菌肽（YFGAP），可抑制G+以及G-细菌，最小抑菌浓度分别为1.2～17.0mg/mL和3.1～12.0mg/mL，没有明显的溶血活性。国内在鱼类体表粘液抗菌肽方面，却鲜有报道。然而，从自然源分离抗菌肽成本高、资源有限，且只对天然肽有用；化学合成能生产抗菌肽，但成本高、安全性低；抗菌肽开发利用所面临的巨大挑战是如何降低生产成本、提高抗菌肽的产量和纯度，同时提高安全性。

表1　鱼类体表粘液抗菌肽的抗菌谱Tabel 1　The antibacterial activity of the antibacterial peptides from fish mucus for Microorganism

2　鱼类体表粘液抗菌肽的分离纯化

随着对抗菌肽研究的深入，抗菌肽的广谱抗菌和巨大抗菌潜能被不断发掘，但在应用上仍受到很大限制。目前，提取抗菌肽主要包括生物体直接提取纯化、人工合成和基因克隆三种方法。生物体直接提取路线的设计都基于抗菌肽带正电荷的短肽。目前已有不少学者通过分离纯化手段获得鱼类体表粘液抗菌肽（表2）。快速发展的基因工程技术则为抗菌肽开发利用提供了更有希望的途径，而其中以细菌为宿主表达抗菌肽是最为经济有效的方法。Y.Nagashima［23］通过凝胶层析和凝胶电泳从岩鱼（Sebastes schlegeli）皮肤分泌液中获得一个抗菌肽，分子量为75ku，pI为4.5，具有α-螺旋结构，含有唾液酸成分，可结合甘露糖。Chan Bae Park［24］利用亲和色谱和反相-高效液相色谱从泥鳅（Mudfish）皮肤中获得一种抗菌肽（misgurin），分子量为2502u，由21个氨基酸残基构成，其中含有5个精氨酸和4个赖氨酸残基，属于强阳离子抗菌肽。董先智［25］从泥鳅（Mudfish）皮肤中获得一种分子量为9.8ku、富含Cys且耐热、具有α-螺旋结构的抗菌肽。Nami Sugiyama［26］利用凝胶层析和反相-高效液相层析技术从六线黑鲈（Grammistes sexlineatus）中分离出4中不同的抗菌肽，均具有α-螺旋结构，对马红细胞具有溶血活。从美洲黄盖鲽（Pleuronectes americanus）［27］、杂交条纹鲈（Moronesaxatilis）［28］、鲶鱼（Parasilurus asotus）［29］、大西洋鲑鱼（Salmo salar）［30］等中获得的抗菌肽，均具有α-螺旋结构，多为阳离子肽。然而，Birkemo GA［31］从大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossu shipposin）中获得的抗菌肽，N-末端乙酰化，pI为12.33，具有两亲性。Fernandes JM［32-33］从虹鳟鱼（Ncorhynchus mykisson corhyncin）中获得两种抗菌肽，分子量分别为7.2、6.7ku，没有明显溶血活性，疑似蛋白片段。虽然已经从上述鱼类的表皮粘液中分离到几十种的抗菌蛋白和肽，但是还未见到鱼类表皮粘液抗菌肽专利的报道，对鱼类表皮粘液抗菌蛋白或肽的进一步分离纯化并克隆基因，将弥补这方面的空白。

表2　抗菌肽的特征Tabel 2　The main characteristics of antibacterial peptides

3　鱼类体表粘液抗菌肽的基因工程

目前，直接从生物体提取分离粘液抗菌肽存在成本高、效率低等缺点。同时由于天然抗菌肽的产量低，而且从机体中提取步骤复杂、产率低，不足以进行科学研究和临床应用，故人工合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段。Kitani Y等［34-35］从岩鱼（Sebastes schlegeli）分离得到的抑菌活性物质SSAP对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），杀蛙气单胞菌（Aeromonas salmonicida），发光杆菌（Photobacterium damselae subsp）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）均有显著作用，SSAP mRNA成功在皮肤和腮上表达。已有报道，确定了12种包括杂交条纹鲈鱼（hybrid striped bass）［36］、大西洋蛙鱼（winter flounder，Atlantic salmon）［37］、斑马鱼（zebrafish）［38］、虹鳟鱼（rainbow trout）［39］、牙鲆（Japanese flounder）［40］、扁口鱼（olive flounder）［41］、斑点叉尾鮰（channel catfish）［42］、真鲷（red sea bream）［43］、日本鲈鱼（Japan sea bass）［44］、美黑鲈（sea bass）［45］和冻黑鲷（black porgy）［46］等十几种鱼类抗菌肽的cDNA和基因组cDNA。Cole等［47］从美洲黄盖鲽（Pleuronectes ferruginea）皮肤cDNA文库及精巢基因组文库分别得到长为317bp和1601bp的pleurocidin cDNA片段及上游启动子序列。该基因由4个外显子和3个内含子组成，与哺乳动物抗菌肽PR239的结构十分相似，成熟肽序列有25个氨基酸，含有4个赖氨酸残基，表现出显著的阳离子特性。Douglas等［48］克隆了4个Pleurodidin基因（WF1-WF4），发现该基因家族内含子数目、位置和各外显子的编码情况与Cole等报道相似，同时还发现，在Pleurocidin家族中，信号肽和酸性羧基端片段的序列高度保守，成熟肽的序列虽不很保守，但都能形成双亲性α-螺旋结构。近年来，在基因工程方面的报道主要集中在对一种鱼类肝脏特异表达抗菌肽（hepcidin）的研究［49］，对鱼类体表粘液抗菌肽的研究报道较少。

4　鱼类体表粘液抗菌肽抑菌机理的研究

目前，鱼类抗菌肽的作用机制主要集中在对pardaxin及其类似物的研究。且关于鱼类抗菌肽的作用机制仍未形成一致的观点，特别是针对抗菌肽抑菌的作用位点始终存有争议。一种观点认为抗菌肽是通过静电作用吸附到细胞膜上，破坏外膜的分子结构，然后通过疏水作用于膜脂双层分子作用，导致膜脂双层改变；当达到一定阈值，聚合形成“桶”状结构，抗菌肽外围疏水基团与膜脂肪酸链相结合；而亲水残基排列在螺旋束内侧组成内孔，形成一种类似离子通道的结构，破坏膜电势，引起胞内水溶性物质大量外漏，导致细菌死亡，达到抑菌效果，即“桶-桶板（barrel-stave）”模型。Oren［50］研究发现pardaxin分子的第7～11位和14～26位均为α-螺旋结构的氨基酸片段，在12～13位处连接两个α螺旋并形成“L”形的“螺旋-转角-螺旋”结构，许多抗菌肽中都存在pardaxin的这种结构，α-螺旋结构的存在与抗菌肽的生物学活性有着重要联系。此外，Oren等还设计了一系列pardaxin的类似物，表明了若破坏pardaxin的α-螺旋结构，其溶血作用显著下降，而对抗菌活性并未影响。但是也有人对上述模型提出了质疑，有些研究表明，部分抗菌肽在最小抑菌浓度时，细菌胞膜完全溶解但无通道形成，Shai等［51］研究表明，未形成跨膜通道、不含α-螺旋结构的pardaxin类似物，仍具有杀菌活性。这些结果提示，抗菌肽的抗菌机理除了通道假说外，可能还存在其他的机制。Pouny等［52］对dermaseptinS及其荧光标记类似物的研究，提出了“地毯”式结构模型，即某些具有双亲性α-螺旋结构的抗菌肽与双亲性磷脂分子相互作用，像地毯样展开平行排列在细胞膜表面扰乱脂膜分子排列，最终裂解细胞膜，达到杀菌效果。Paul等［53］还发现酰化后的pardaxin可以穿透细胞膜进入细胞并聚集在核仁中，与细胞内DNA或RNA结合，通过破坏细胞正常功能而杀菌。由此说明，抗菌肽可能还存在更为复杂的抗菌机制。鱼类抗菌肽的作用机理还不是很清楚，鱼类体表粘液抗菌肽的抗菌机制更是鲜有研究，有待深入研究。

5　鱼类体表粘液抗菌肽在食品工业方面的应用前景

抗菌肽对食品中的多种革兰阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，对一些恶性肿瘤病毒也能发挥作用，而且抗菌机制独特，不易产生抗性。因此，抗菌肽不仅在工业、农业、畜牧业及医药等方面可以发挥重要作用，在食品工业方面也具有广阔的应用前景。由于生物保鲜剂直接来源于生物体的自身组成成分或其代谢产物，具有安全无毒等优点，且易发生降解，造成二次污染较小，因此，生物保鲜剂的开发和应用已经成为水产品保鲜领域研究的热点和发展趋势。

目前应用于水产品、肉制品、果蔬、乳制品等食品的贮运、加工等过程中的保鲜剂主要以绿色生物保鲜技术为主［54］。生物保鲜剂按其来源主要可以分为植物源、动物源以及微生物源等。植物源保鲜剂主要包括茶多酚、迷迭香、大蒜素等，Li等［55］研究表明，茶多酚和迷迭香提取物可以延长花鲫鱼的货架期。动物源保鲜剂主要包括壳聚糖、蜂胶、溶菌酶等，李婷婷等［56］采用不同浓度的壳聚糖对美国红鱼片涂膜后于4℃冷藏，其中壳聚糖涂膜浓度为2%时，保鲜效果最佳，能够延长美国红鱼片的货架期4～6d。微生物源保鲜剂主要包括可以在食物中定向保存有益菌群（如乳酸菌）和防止有害菌群的乳酸链球菌素（Nisin）和乳酸菌发酵液等［57］。邱芳萍等［58］发现从吉林林蛙中提取的抗菌肽对香肠、草莓均具有较好的防腐保鲜效果，在香肠中可以部分替代亚硝酸钠，可以全部或部分替代山梨酸钾。研究表明，喷洒了吉林林蛙抗菌肽的草莓能够保存120h不腐烂，对照组仅能保存72h。鱼类体表粘液抗菌肽对微生物有抑制作用，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，溶解性好，性质稳定。因此，应用抗菌肽延长食品的货架期可能会成为食品研究领域的一个热点。

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Progress research on fish epidermal mucus antimicrobial peptides

LI Ting-ting1，ZHANG Hui-fang2，JIN Gao-wei2，JIANG Yang2，LI Jian-rong2，*
（1.College of Life Science，Dalian Nationality of University，Dalian 116600，China；2.Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

The research on fish epidermal mucus ingredients had made certain progress in recent years，such as complement and interferon against bacteria indirectly，as well as lectins，lysozyme and non-specific immune factors against bacteria directly.However，the research on fish epidermal mucus antimicrobial peptides was less.Fish epidermal mucus antimicrobial peptides were important parts of innate immunity to bacterial invasion. Except for broad-spectrum antibacterial activity，epidermal mucus antimicrobial peptides have more biological activities on the resistance of fungi，virus，parasite and tumor，but scarcely induce drug resistance，which shows an obvious application prospect.It was summarized progress of antimicrobial peptides on antibacterial activity，purification，gene engineering，mechanism of action and application prospect on the food industry.

fish epidermal mucus antimicrobial peptides；antibacterial activity；mechanism of action；application prospect

TS254.9

A

1002-0306（2015）12-0358-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.068

2014－09－11

李婷婷（1978-），女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工及质量安全控制方面的研究。

励建荣（1964-），男，博士，教授，主要从事水产品和果蔬贮藏加工及质量安全控制方面的研究。

国家自然科学基金（31301572，31471639）；中国博士后科学基金（2014M552302）；“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD29B06）；高等学校博士学科点专项科研基金（优先发展领域）（20113326130001）。