副猪嗜血杆菌分离株的分离鉴定及药敏试验

董永军，王丽荣，徐银兰，贺会利，赵俊江，孟伟杰

（1.河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003；2.河南科技学院抗体工程重点实验室）

副猪嗜血杆菌分离株的分离鉴定及药敏试验

董永军1，2，王丽荣1，2，徐银兰1，贺会利1，赵俊江1，孟伟杰1

（1.河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003；2.河南科技学院抗体工程重点实验室）

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Hps）引起的一种细菌性传染病.从疑似发生副猪嗜血杆菌病的河南新乡某猪场采集病猪呼吸道分泌物和心包积液，并对样品进行细菌分离培养、形态观察、培养特性、生化试验鉴定和动物试验。结果表明，该试验成功分离到了副猪嗜血杆菌，药敏试验显示，分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头抱哌酮高敏，对复方新诺明中敏，对青霉素、链霉素、林可霉素耐药；对金银花及其组成的复方敏感，且复方作用效果优于单方。

副猪嗜血杆菌；分离鉴定；药敏试验；猪

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于猪上呼吸道的一种常在菌，在特定条件下可以侵入机体引起以呼吸道症状为主的全身性疾病，即副猪嗜血杆菌病，又称革拉瑟氏病［1-2］。

副猪嗜血杆菌属革兰氏染色阴性的细小杆菌，具有多种不同的形态，显微镜下可见呈球杆状、长杆状与长丝状菌体，无鞭毛、无芽抱，有荚膜，兼性厌氧［3-5］。

目前，副猪嗜血杆菌病已严重危害到养猪业的健康发展，分离鉴定副猪嗜血杆菌并进行药敏试验意义重大，对该病的预防、控制有着非常重要的作用［6-8］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 从疑似发生副猪嗜血杆菌病的河南省新乡市某猪场采集发病猪的呼吸道分泌物、心包积液。

1.1.2 试剂 葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脉酶等生化微量鉴定管；营养琼脂，烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD或V因子），金黄色葡萄球菌；生化试验试剂：脉酶、氧化酶、接触酶、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和核糖等。

1.1.3 培养基 兔鲜血琼脂平板、巧克力琼脂平板、普通营养琼脂平板、TSB培养基在实验室按常规

方法制备。

1.1.4 中药 板蓝根、大青叶、金银花、贯众、鱼腥草、野菊花、黄答、连翘。复方①黄答、金银花、连翘。复方②大青叶、鱼腥草、贯众。

1.1.5 西药 环丙沙星、氧氟沙星、头抱哌酮、复方新诺明、林可霉素、诺氟沙星、青霉素、链霉素及庆大霉素药敏片（河南科技学院药理实验室制备）。

1.2 病原菌分离及鉴定

1.2.1 病原菌分离 无菌条件下，用接种环挑取疑似患猪呼吸道分泌物或心包积液，划线接种于巧克力琼脂平板和普通营养琼脂平板，置5%CO2培养箱中，37℃恒温培养48 h后，取出培养基，挑取疑似副猪嗜血杆菌单个菌落，进行纯培养。

1.2.2 涂片镜检 挑取上述纯培养疑似副猪嗜血杆菌单个菌落，分别涂片、革兰氏染色后，显微镜下观察菌体形态及染色结果。

1.2.3 卫星现象检查 无菌条件下，挑取副猪嗜血杆菌疑似菌落，水平划线于未添加NAD的兔鲜血琼脂平板，再挑取金黄色葡萄球菌垂直水平划线接种于平板，置5%CO2培养箱中37℃恒温培养24～48 h后，观察细菌生长情况，是否有卫星生长现象及溶血现象。

1.2.4 生化试验 挑取具有卫星生长现象且不溶血的单个菌落纯培养后接种于添加NAD的含葡萄糖、半乳糖、蔗糖、脉酶等生化微量鉴定管中，置5% CO2培养箱中37℃恒温培养24～48 h后，观察生化反应和糖发酵活性结果，同时进行氧化酶试验和接触酶试验，观察结果。

1.2.5 动物试验 将疑似副猪嗜血杆菌的平板上菌落用灭菌生理盐水洗下，经二次离心沉淀洗涤后悬浮于3 ml生理盐水中，各取0.4 m L静脉接种于3头哺乳仔猪体内，观察其表现，死后解剖采集呼吸道分泌物，进行二次分离鉴定。

1.3 药敏试验

1.3.1 中药 按传统水煎法煎煮，真空抽滤及浓缩，最后浓缩为1 g/mL生药，置-20℃保存。滤纸打孔直径为6 mm，121℃高压灭菌，将纸片放入药液中浸泡2 h，置37℃烘干，于-20℃保存备用。将确诊的副猪嗜血杆菌菌落接种于TSB培养基中，在超净台中利用灭菌棉签从TSB中蘸取少量均匀涂布于添加有NAD的兔鲜血琼脂平板上，稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别贴于平板上，37℃培养24 h后，观察测定抑菌圈直径。

1.3.2 西药 将确诊的副猪嗜血杆菌菌落接种于TSB培养基，在超净台中利用灭菌棉签从TSB中蘸取少量均匀涂布于添加有NAD的兔鲜血琼脂平板上，稍干后，用无菌镊子将药敏纸片分别贴于平板上，37℃培养24 h后，观察测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果 将呼吸道分泌物或心包积液分别接种于巧克力琼脂平板和普通营养琼脂平板，37℃培养48 h后，通过实验观察结果如下。

普通营养琼脂平板上无菌落生长；巧克力琼脂平板上生长有边缘整齐、小而透明菌落。

2.2 涂片镜检结果 采集疑似副猪嗜血杆菌单个菌落抹片、革兰氏染色后显微镜观察，可见大小不等，短小杆状、球杆状、丝状等多种不同形态细菌，革兰氏染色阴性。

通过细菌分离培养与形态、革兰氏染色观察，初步判定该细菌为副猪嗜血杆菌，确诊需进一步进行生化试验。

2.3 卫星现象检查结果 通过实验观察：在金黄色葡萄球菌周围可见生长有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落，离金黄色葡萄球菌愈近菌落生长越好，愈远菌落越小，呈现出明显的“卫星现象”，同时未见溶血现象；未接种金黄色葡萄球菌的另一平板则未见菌落生长。

2.4 生化试验结果 详见表1。

表1 生化试验结果

根据细菌形态、革兰氏阴性、卫星生长现象、不溶血现象，结合生化试验结果可以确诊，分离细菌符合副猪嗜血杆菌的生物学特性。

2.5 动物试验结果 经静脉接种的3头供试哺乳仔猪均出现精神沉郁，食欲减退，体温升高至40.5℃～42℃，咳嗽，呼吸困难，皮肤发红，皮肤黏膜发绀，腕关节和跗关节肿胀、跛行、站立困难，疼痛。死前共济失调、抽搐、四肢呈划水状。

病理剖检可见心包积液，呼吸道内有大量分泌物。采集分泌物按上述方法进行第二次细菌分离鉴定，结果一致，确诊该细菌为副猪嗜血杆菌。

2.6 药敏试验结果

2.6.1 中药 37℃培养24 h后，测定药敏纸片抑菌圈大小，结果详见表2。

单味中药金银花、鱼腥草、野菊花、板蓝根抑菌作用良好，尤以金银花效果较优；2种复方均有抑菌作用，尤以复方1最优。药敏试验结果表明，金银花及其复方对副猪嗜血杆菌的抑菌作用明显。黄答、连翘对副猪嗜血杆菌无明显抑菌作用，但与金银花组方效果优于单方金银花，可能与组方各种中药相须协同作用有关。

表2 中药药敏试验结果

2.6.2 西药 结果详见表3。

结果显示，庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头抱哌酮高敏；复方新诺明中敏，青霉素、链霉素、林可霉素耐药。

表3 副猪嗜血杆菌西药药敏试验结果

Hps血清型较多，目前报道有15种，不同菌株对同一种抗生素的敏感性存在很大差异，临床治疗应结合分离菌株的药敏试验结果，科学用药。

3 小结与讨论

本试验通过对疑似发病猪场采集患猪病料，并进行病原菌分离鉴定、动物试验，鉴定为副猪嗜血杆菌。

通过药敏试验，确诊分离菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头抱哌酮高敏，复方新诺明中敏，青霉素、链霉素、林可霉素耐药；对金银花及其组成的复方敏感，且复方作用效果优于单方［9］。

副猪嗜血杆菌病临床治疗上中药建议使用金银花及其组成复方，西药建议使用庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头抱哌酮。

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S858.28

A

1005-7307（2015）01-0001-003

2014-12-05

新乡市重点科技攻关项目（ZG13009）；河南科技学院大学生创新训练计划项目（2013CX046）

董永军，男，硕士，讲师，主要从事基础兽医学的教学科研工作。