调心安神针法调节室性心律失常模型兔心肌细胞Cx43表达的免疫组化研究

王锐，郭丽，李永春，崔华峰，管琳

（1.山东中医药大学附属医院，济南 250011；2.山东中医药大学，济南 250011）

·动物实验·

调心安神针法调节室性心律失常模型兔心肌细胞Cx43表达的免疫组化研究

王锐1，郭丽1，李永春2，崔华峰1，管琳1

（1.山东中医药大学附属医院，济南 250011；2.山东中医药大学，济南 250011）

目的 研究调心安神针法对于室性心律失常模型兔心肌细胞缝隙连接蛋白 43（connexin43，Cx43）的影响。方法采用兔耳缘静脉注射氯化钡的方法制作室性心律失常模型。40只新西兰兔随机分为对照组、模型组、针刺组、药物组，针刺组施以调心安神针刺法（取灵台、神道及双侧内关、百会），药物组给予盐酸普罗帕酮片（心律平）灌胃。实验完毕后取兔左心室，通过免疫组织化学染色技术及计算机图像处理系统对Cx43的表达进行对比分析。结果 模型组Cx43的表达较对照组显著降低（P＜0.01），针刺组及药物组Cx43的表达均较模型组增加（P＜0.05），二者之间无明显差异（P＞0.05）。结论 调节心肌细胞Cx43的表达可能是该针法治疗心律失常的靶点之一。

针刺；调心安神针法；心律失常，室性；缝隙连接蛋白43；免疫组织化学法

室性心律失常是临床常见的心脏疾病，严重影响患者的生活质量，甚者危及生命。有研究发现，室性心律失常是年龄超过 35岁成人的几个心源性猝死的危险因素之一［1-3］。近年来的研究表明，缝隙连接蛋白43（Cx43）在室性心律失常发生中具有重要作用［4-6］。笔者基于多年临床经验，由灵台、神道、内关、百会穴组成调心安神方，并施行特定的手法操作，治疗早搏取得了满意的疗效［7］。我们采用兔耳缘静脉注射氯化钡的方法制作室性心律失常模型，观察调心安神针法对其心肌细胞Cx43的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

新西兰兔40只，体重1.5～2.0 kg，雌雄各半，由山东省农科院提供，合格证号为 SCXK（鲁）20090013。一抗为兔抗 Cx43，购自北京博奥森生物技术有限公司，批号为990387W。二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为 101964。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为12171A08。

1.2 分组与建模

40只新西兰兔按照随机数字表法分为4组，即对照组、模型组、针刺组、药物组，每组10只。用10%水合氯醛按 5 mL/kg腹腔注射麻醉（药物组给药 1 h后），仰位固定于固定台上。将针形电极插入四肢远端皮下，选择标准Ⅱ导联，待心电图稳定后沿耳缘静脉注射20%氯化钡10 mL/kg造成室性心律失常模型。药物组予盐酸普罗帕酮40 mg/kg灌胃，其余各组不予处理。

1.3 针刺方法

参照中国针灸学会《动物针灸穴位图谱》，针刺组于造模后即刻给予针刺内关、百会、灵台、神道。灵台、神道穴位于背部胸椎6-7及5-6棘突间，向上斜刺5 mm，用震颤法快速小幅度行针1 min后起针；百会穴位于第7腰椎与第1荐椎棘突间，向后平刺5 mm；内关穴位于前臂下1/6折点处内侧，桡、尺骨间隙中，双侧内关分别直刺5 mm，行针1 min后接电针治疗仪，选疏密波，刺激强度以家兔上肢出现轻微颤动为度。各组均观察体表心电变化，留针至恢复正常心律后停止记录，拔出针形电极，立即处死动物，取左心室。

1.4 观察指标

1.4.1 心电图时相性观察

采用十二导电生理记录仪记录心电变化，以心律失常消失300 s以上为恢复正常心律。

1.4.2 心肌细胞Cx43免疫组化检测

将心脏组织置于40 g/L中性甲醛液中固定，经石蜡包埋后，连续切片3张，切片厚4 μm，其中1张用于HE染色以观察组织的大致形态，另2张用于免疫组织化学染色。采用SP法，操作步骤按试剂盒说明书进行。在OLYMPUS光学显微镜下10×40倍放大拍照，每张切片随机观察5个视野，Leica Qwin3软件分析系统分析阳性表达面积。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件，数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 室性心律失常持续时间比较

结果表明，模型组、针刺组及药物组造模后均出现室性心律失常，以室性早搏为主，其次为室速。模型组心律失常持续时间为（36.4±21.5）min，针刺组心律失常持续时间为（17.1±9.8）min，药物组心律失常持续时间为（12.6±6.2）min，3组持续时间比较，模型组最长，针刺组次之，药物组最短。针刺组、药物组与模型组比较均有显著差异（P＜0.05），针刺组与药物组之间无差异（P＞0.05）。

2.2 各组心肌组织HE染色

对照组心肌组织结构正常，无异常形态学改变。模型组心肌组织中可见部分心肌纤维肿胀，核明显变大，少数心肌细胞胞浆嗜伊红染色增强，心肌细胞之间可见连接疏松，心肌间质血管外膜增厚、水肿，累及部分中膜，增厚的血管周围心肌纤维肿胀，胞浆疏松，血管周围组织疏松。针刺组与药物组少数心肌细胞肿胀、细胞间轻度疏松溶解，心肌间质组织中血管管壁轻度增厚，偶见小灶状心肌纤维变性；小血管轻度增厚，外膜轻度水肿。详见图1。

图1 各组心肌组织HE染色（×400）

2.3 各组心肌组织免疫组化染色

2.3.1 染色比较

对照组心肌细胞中可见较多的棕黄色 CX43蛋白表达，模型组则较少表达或消失，针刺组与药物组中可见部分棕黄色CX43表达。详见图2。

图2 各组心肌组织免疫组化染色（×400）

2.3.2 Cx43阳性表达面积比较

模型组、针刺组、药物组Cx43阳性表达面积检测灰度值分别为（127.9±16.7）、（177.7±19.4）、（186.5±13.3），对照组为（206.7±11.3），结果表明，模型组、针刺组、药物组Cx43阳性表达面积均较对照组明显降低（P＜0.01），对照组与药物组较模型组明显增加（P＜0.01），针刺组与药物组之间无差异（P＞0.05）。

3 讨论

静脉注射氯化钡是造成室性心律失常模型的常用方法之一［8］。氯化钡可增加浦氏纤维Na+内向电流，提高舒张期去极化的速率，从而诱发异位性节律。我们给予兔耳缘静脉注射氯化钡的剂量为10 mg/kg，发现诱发兔的心律失常主要为室性早搏和室性心动过速。

细胞缝隙连接通道是相邻细胞电学和化学代谢耦联的基础，Cx43是其构成的主要电耦联蛋白。心肌细胞Cx43的重构会致心肌细胞间电活动的同步性、协调性改变，电传导速度及各向异性的改变等，从而诱发心律失常。动物实验研究证实，Cx43表达下降的程度对诱导室性心律失常的发生具有重要的影响［2］，心肌缺血病灶及其邻近区域Cx43的数量及分布的高度不均一性是折返性心律失常的结构基础［9］。近年合成的抗心律失常多肽即通过上调Cx43的磷酸化水平而发挥抗心律失常作用［10］。盐酸普罗帕酮片（心律平）作为临床上最常用的抗心律失常药物，能降低蒲肯野氏纤维、心室肌和心房肌的自律性，减慢其传导速度，有轻度β-受体阻断作用和轻微的钙通道阻滞作用［11］。实验结果表明，盐酸普罗帕酮片平能降低模型兔室性心律失常持续时间，并能增加心肌细胞中Cx43的表达。对于后者，我们推测，这可能是盐酸普罗帕酮片通过抑制细胞内Ca2+，从而影响Cx43的磷酸化过程，最终影响Cx43的表达。

内关穴对心脏有相对特异性。以往的研究发现，针刺内关穴可改善左心功能，增强心肌缺血时的收缩力［12］，增加心肌组织灌流量，改善末梢循环，纠正由于心肌缺血而诱发的心律失常［13］，减少了后除极电位和心律不齐的发生率［14］。灵台、神道穴对于早搏也具有相对特异性的治疗作用［15］，在调心安神针法中要求两穴的操作须力求使针感向前胸或侧胸部放散，即“气至病所”。有学者认为，Cx43可能是构成穴位的主要物质基础之一，针刺后穴位处Cx43表达增加激活了间隙连接通道，促进了Ca2+、cAMP、IP3或其他小分子物质快速传递至相应脏器，形成了“气至病所”的物质基础［16］，进而调节脏器功能。

本实验表明，造模后给予调心安神针法，可以减少心肌细胞的损伤，明显缩短室性心律失常持续时间，增加左心室心肌细胞中Cx43的表达。众所周知，针刺治疗心律失常是个多靶点、多层次、多途径的过程。虽然调心安神针法增加心肌细胞中Cx43表达的过程和机制尚不清楚，但我们认为，这可能是该针法治疗室性心律失常的机理之一。

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Immunohistochem ical Study of Heart-regulating and M ind-calm ing Acupuncture for Ad justing Cx43 Expression in M yocardial Cells in a Rabbit M odel of Ventricular Arrhythmia

WANG Rui1, GUO Li1, LI Yong-chun2, CUI Hua-feng1, GUAN Lin1.
1.S handong University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Jinan 250011,China; 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China

Objective To investigate the effect of heart-regulating and mind-calming acupuncture on the expression of gap junction protein connexin43 (Cx43) in myocardial cells in a rabbit model of ventricular arrhythmia. Method A rabbit model of ventricular arrhythmia was made by injecting barium chloride into the marginal ear vein. Forty New Zealand rabbits were randomized into control, model, acupuncture and medication groups. The acupuncture group received heart-regulating and m ind-calming acupuncture [at Lingtai (GV10), Shendao (GV 11), bilateral Neiguan (PC6) and Baihui (GV20)] and the medication group, oral gavage of propafenone. Rabbit left ventricle was taken after the completion of the experiment. Cx43 expressions were compared and analyzed using an immunohistochem ical staining technique and a computer image processing system. Result Cx43 expression decreased significantly in the model group compared w ith the control group (P＜0.01) and increased in the acupuncture and medication groups compared w ith the model group (P＜0.05). There was no significant difference in Cx43 expression between the acupuncture and medication groups (P＞0.05). Conclusion Adjusting Cx43 expression in myocardial cells may be one of the target points for this acupuncture treatment of arrhythm ia

Acupuncture; Heart-regulating and mind-calming acupuncture; Arrhythmia, ventricular; Gap junction protein connexin43; Immunohistochemical method

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.12.1241

1005-0957（2015）12-1241-03

2015-04-20

国家中医药管理局针灸重点学科重点项目；山东省中医药科技发展计划项目（2013ZDZK-014）

王锐（1965 - ），男，主任医师，Email：wr_6510@163.com