藏灵菇发酵产胞外多糖的影响因素及其应用研究

王　辑，田　政，赵　笑，曹永强，杨贞耐，*（.北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京00048；.北京顺鑫农业股份有限公司，北京0300）

藏灵菇发酵产胞外多糖的影响因素及其应用研究

王辑1，田政2，赵笑1，曹永强1，杨贞耐1，*
（1.北京工商大学，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048；2.北京顺鑫农业股份有限公司，北京101300）

利用苯酚-硫酸法从15个不同地区藏灵菇样品中筛选出3个高产胞外多糖样品（K4、K7、K12）。通过单因素分析确定K4、K7、K12高产胞外多糖的条件为：接种量K4为9%、K7和K12为7%；发酵时间K12为12 h、K4和K7为18 h；发酵温度均为37℃；脱脂乳浓度均为11%。藏灵菇K4、K12分别与商业发酵剂搭配制备发酵乳，结果表明，K12发酵乳的凝乳时间最短（4.52 h），胞外多糖含量和活菌数分别保持在50 mg/L左右和8.20 log cfu/mL以上，且具有较高的持水力和黏度。

藏灵菇，胞外多糖，发酵乳，乳酸菌

藏灵菇（又称开菲尔粒）是由多种微生物共生形成的一种不规则的、含有黏性多糖的粒状混合物，此混合物中栖息的多种乳酸菌、酵母菌、醋酸菌，形成一个稳定的共生体系［1］。藏灵菇是一种天然的乳品发酵剂，具有良好的发酵特性，用它制作的酸奶与传统的酸奶或用其他纯种乳酸菌发酵剂制成的产品有很大的不同，最显著的特征是除乳酸发酵外，还伴有轻微的由酵母菌引起的酒精发酵，是一种集酸、乙醇味于一体的新型发酵乳制品［2］。据报道，藏灵菇发酵乳中含有大量的乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs），该类多糖具有多种生理功能，如抑制有害菌生长，抗肿瘤活性和调节肠道免疫系统等［3］。此外，由于EPS还具有防止乳清析出、提高黏稠度、凝乳强度，防止凝乳断裂等优点［4-5］，已成为近年来应用较为广泛的食品级稳定剂或增稠剂。

影响EPS合成的因素除了产生菌的遗传特性外，还有环境因素，如培养基成分（碳源、氮源、碳氮比、刺激生长因子、无机盐等）、培养基初始pH、接种量、发酵温度和时间等［6］。近年来，有关EPS产量的发酵条件优化研究主要集中在单株菌上，藏灵菇作为多种微生物的混合体，其EPS产量（5～10 g/L）要远远高于单株乳酸菌（50～425 mg/L）［7-8］，且具有更多的生理活性。本研究主要通过单因素（接种量、发酵温度、发酵时间和脱脂乳浓度）实验分析藏灵菇高产EPS的条件，进一步研究高产EPS藏灵菇在牛乳中的发酵特性（凝乳时间、pH、滴定酸度、持水力、黏度和活菌数），以期为深入研究藏灵菇EPS的理化特性及应用提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

藏灵菇采自全国不同地区（表1），于4℃条件下冷藏备用；全脂乳北京三元食品股份有限公司；脱脂乳粉新西兰恒天然乳业集团；商业酸奶发酵剂（YO-MIX） 丹麦丹尼斯克公司；三氯乙酸（TCA）、氢氧化钠、乙酸、浓硫酸、重蒸酚、乙醇分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

表1　藏灵菇样品来源Table 1　Sources of Tibetan Kefir samples

MLS-3750型高压蒸汽灭菌器日本三洋公司；CR21GⅢ型立式高速冷冻离心机号、U-3900型紫外可见分光光度计日本HITACHI公司；DV-Ⅲ型ULTRA黏度计美国BROOKFIELD公司；数显pH计上海梅特利-托利多公司；恒温培养箱上海一恒仪器科技有限公司。

表2　发酵剂组合情况Table 2　Combination of starter culture

1.2培养基的配制

1.2.1SDM液体培养基（1 L） 胰蛋白胨10 g、YNB（酵母氮源）6.7 g、K2HPO42 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸钠 5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、葡萄糖 20 g、吐温80 1 mL，1 mol/L乙酸调pH为6.6，121℃灭菌15 min。

1.2.2还原脱脂乳培养基（Reconstituted skim milk，RSM） 将脱脂乳粉按照11%（w/v）用蒸馏水还原制成脱脂乳培养基，115℃灭菌15 min。

1.3藏灵菇EPS的分离提取

将藏灵菇用冷的无菌水清洗后接种至RSM培养基中，于25℃静置培养16～20 h，至牛乳凝固，过滤，得到的藏灵菇继续接种至RSM培养基中，连续活化几代备用。将活化好的藏灵菇样品按5 g/100 mL的比例分别接种于SDM及RSM培养基中，37℃静置培养18 h。待发酵结束后，于100℃水浴加热15 min，以灭活可能存在的降解多糖的酶类。EPS的分离提取参照Rimada等［9］的方法。向藏灵菇发酵液中加入80%（m/v）的三氯乙酸溶液至终浓度为4%（m/v），室温下搅拌2 h，10000 r/min，4℃，离心45 min，去除细胞和蛋白。取上清液并加入两倍体积的无水乙醇，4℃冷藏静置12 h，10000 r/min，4℃，离心30 min。沉淀用蒸馏水溶解，装入分子截流量为8000～14000 u的透析袋中透析24 h，每8 h换一次蒸馏水。

1.4藏灵菇产EPS单因素实验

选取高产EPS藏灵菇样品，对其在还原脱脂乳培养基中产EPS的发酵条件进行初步研究。以EPS产量为指标，选择接种量为3、5、7、9、11、13 g/100 mL（其他发酵条件：发酵温度37℃、发酵时间18 h、脱脂乳浓度11%）；发酵温度为22、27、32、37、42℃（其他发酵条件：接种量7%、发酵时间18 h、脱脂乳浓度11%）；发酵时间为6、12、18、24、30 h（其他发酵条件：接种量7%、发酵温度37℃、脱脂乳浓度为11%）；脱脂乳浓度为7、9、11、13、15 g/100 mL（其他发酵条件：接种量7%、发酵温度37℃、发酵时间18 h）分别进行单因素实验。

1.5高产EPS藏灵菇在发酵乳中的应用

在单因素实验所确定的条件下选用高产EPS藏灵菇制备发酵乳，研究其发酵特性。藏灵菇与商业发酵剂经脱脂乳活化后，按表2组合分别接种于全脂牛奶中，于42℃下发酵至pH为4.5，迅速置于冷水中冷却至4℃，转移至4℃冷库中冷藏。分别在冷藏期的第1、7、14、21 d取样，测定发酵乳的EPS含量、活菌数、pH及滴定酸度、持水力及黏度。

1.6指标的测定

1.6.1EPS含量测定取20 mL发酵乳，按照1.3中的方法提取EPS。采用苯酚—硫酸法测定EPS含量，以葡萄糖为标准品制作标准曲线［10］，测得的葡萄糖标准曲线公式为：y=0.0087x＋0.0232，R2=0.9994。纵坐标为490 nm处的吸光度值，横坐标为溶液中EPS质量浓度（mg/L）。EPS含量为样品含糖量减去空白培养基的背景干扰值。

1.6.2活菌数测定采用平板涂布稀释法测定发酵乳中乳酸菌的活菌数。称取0.5 g发酵乳样品加入到4.5 mL无菌生理盐水中逐级稀释［11］，选取合适的稀释倍数涂布于MRS琼脂培养基上，置于37℃培养48 h后计数。

1.6.3pH和滴定酸度的测定发酵乳pH用数显pH计直接读取。滴定酸度采用Purwandari等［12］的方法进行测定。称取发酵乳样品10 g，加入10 mL蒸馏水，混匀后，加入0.5 mL 0.5%的酚酞指示剂，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定，直到粉红色出现，记录消耗NaOH的体积。滴定酸度计算公式为：

1.6.4持水力的测定称取5 g发酵乳样品，5000 r/min，4℃，离心15 min。收集上清并称重。持水力计算公式如下：

1.6.5黏度的测定将发酵乳样品于室温下放置1 h，用玻璃棒将其搅拌均匀，选用LV-3转子，设定转速50 r/min，每5 s取一个点，连续测定12个点，黏度为12个点的平均值。

1.7数据分析

每个样品均设3次重复。数据以表示，采用SPSS 12.0软件进行方差分析，p＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著。

2　结果与分析

2.1藏灵菇EPS产量测定

葡萄糖标准曲线如图1所示。来自不同地区的15个藏灵菇样品在SDM和RSM培养基中产EPS情况如图2所示。15个藏灵菇样品在SDM和RSM培养基中均能产生EPS，但含量有所差异。在SDM培养基中EPS产量在130～1020 mg/L，其中编号为K4、K7、K8、K10、K12的藏灵菇样品的EPS较高，分别为905.6、931.2、716.18、793.32、1016.9 mg/L，均超过700 mg/L。在RSM培养基中EPS产量在13～242 mg/L，其中编号为K4、K5、K7、K8、K10、K12、K15的藏灵菇样品EPS产量较高，分别为175.6、104.4、241.40、143.22、113.90、 201.40、129.35 mg/L，均超过100 mg/L。由此可见，藏灵菇在SDM培养基的EPS产量要显著高于在RSM培养基中的产量，表明碳源和氮源对EPS的产量影响较大。

图1　以葡萄糖为基准物质的标准曲线Fig.1　Standard curve with glucose as a benchmark substance

图2　藏灵菇分别在SDM和RSM培养基中的EPS产量Fig.2　EPS yields of Tibetan Kefir samples in SDM and RSM mediums，respectively

2.2接种量对EPS产量的影响

接种量的多少直接影响到微生物的生长速度和菌体浓度，进而影响EPS产量。由图3可以看出，同一藏灵菇样品在不同接种量下代谢产生的EPS的产量也不尽相同。K4、K7和K12的EPS产量随接种量的增加呈现先升高后降低的趋势。藏灵菇K4在接种量为9%时EPS产量达到最高，为288.35 mg/L，而藏灵菇K7和K12在接种量为7%时EPS产量达到最高，分别为241.44 mg/L和260.30 mg/L。过高的接种量，发酵前期会使菌体生长过快，菌体浓度过高，中后期会因营养物质消耗殆尽而导致合成EPS的前体物质的减少，从而降低EPS的产量。

图3　接种量对藏灵菇EPS产量的影响Fig.3　Effect of inoculum dose on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.3发酵温度对EPS产量的影响

温度是影响微生物生长繁殖和EPS合成的重要因素之一。发酵温度不同，菌株的生长速度及其EPS产量亦不相同。发酵温度过低，藏灵菇中的微生物菌体生长缓慢，菌体浓度不高，从而影响次生代谢产物EPS的产量；发酵温度过高，菌体培养后期容易衰老而自溶，菌体浓度亦不高，也会影响EPS的合成［6］。由图4可以看出，藏灵菇样品在不同发酵温度条件下其EPS产量不同，当发酵温度为37℃时，藏灵菇K4、K7和K12的EPS产量均达到最大值。而当发酵温度低于37℃时，可能是由于藏灵菇中的菌体生长缓慢，菌液浓度较低，亦可能是低温使类异戊二烯脂质载体发生钝化现象，使得EPS产量降低［13］。类异戊二烯脂质载体在细胞内除了被用于EPS的合成外，也参与细胞壁肽聚糖、磷壁酸的生物合成。此外，当温度高于37℃时，EPS产量开始下降，这可能是由于藏灵菇中的菌体容易衰老而发生自溶现象，且温度过高导致载体失活，从而降低EPS的产量。因此，藏灵菇K4、K7和K12的EPS合成的最适温度均为37℃。

图4　发酵温度对藏灵菇EPS产量的影响Fig.4　Effect of fermentation temperature on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.4发酵时间对EPS产量的影响

发酵时间长短对EPS的产量影响较大。一般EPS在菌体的对数生长末期和稳定期产生。因此适当延长发酵时间有助于EPS的积累［14］。由图5可以看出，藏灵菇EPS的产量随发酵时间的延长不断升高，K4和K7的EPS产量在18 h时达到最高值（288.35 mg/L和241.44 mg/L），而K12的EPS在12 h时达到最高值（366.90 mg/L），这表明K4和K7中产EPS的菌株在18 h左右达到生长稳定期，而K12中产EPS的菌株在12 h左右达到生长稳定期。稳定期时活菌数保持相对稳定、总菌数达到最高水平、细胞代谢产物积累达到最高峰，同时培养基中的碳源、氮源的消耗也达到最大。当继续延长发酵时间，藏灵菇K4、K7和K12的EPS产量均出现急剧下降趋势，这可能是由于底物的营养价值已被消耗尽，无法继续提供菌株细胞生长及EPS的分泌，从而造成EPS产量下降，也可能是微生物代谢产生了分解多糖的酶类将多糖重新分解［15］。

图5　发酵时间对藏灵菇EPS产量的影响Fig.5　Effect of fermentation time on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.5脱脂乳浓度对EPS产量的影响

碳、氮源是微生物生长最重要的能量和营养来源，对微生物EPS的合成有很大影响。牛乳中的碳源主要为乳糖，氮源主要为酪蛋白。由图6可以看出，藏灵菇EPS的产量随脱脂乳浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。K4、K7和K12的EPS均在脱脂乳浓度为11%时达到最高，当大于11%时EPS的产量反而降低，表明高浓度的脱脂乳不利于EPS的合成。

图6　脱脂乳浓度对藏灵菇EPS产量的影响Fig.6　Effect of skim milk concentration on the yields of Tibetan Kefir EPS

2.6高产EPS藏灵菇在发酵乳中的应用

2.6.1发酵乳冷藏期间EPS含量的变化发酵乳冷藏期间EPS产量的变化见图7。可以看出，同一组发酵乳的EPS含量随冷藏天数延长变化不大，但不同组发酵乳之间的EPS产量存在显著差异。其中YO-MIX发酵乳在冷藏期间EPS含量始终保持在10 mg/L左右，K4和K12发酵乳的EPS含量在41～54 mg/L，YO-K4发酵乳EPS含量维持在40 mg/L左右，YO-K12发酵乳EPS含量维持在50 mg/L左右。

图7　发酵乳4℃冷藏期间EPS的变化情况Fig.7　Change in EPS yields of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.2发酵乳凝乳时间及冷藏期间活菌数的变化发酵乳凝乳时间及冷藏期间乳酸菌活菌数变化情况见表3。各组发酵乳的凝乳时间存在显著差异，其中由高产EPS藏灵菇K12+商业发酵剂混合（YO-K12）制备的发酵乳的凝乳时间最短（4.52 h），其次为商业发酵剂YO-MIX（4.85 h）、K4和商业发酵剂混合YOK4（5.34 h）、K12（6.42 h）和K4（7.00 h），表明高浓度的EPS含量可加速牛乳的凝乳速度。Girard［16］研究了产EPS乳酸乳球菌NCC2771、NCC1971、NCC15在发酵乳中的酸化曲线，发现产EPS菌种可以缩短凝乳时间。马世敏等［17］研究发现在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵剂的基础上添加产EPS的副干酪乳杆菌HCT制备发酵乳，凝乳时间可缩短0.5 h。此外，各组发酵乳的活菌数随着冷藏时间的延长而逐渐增加，在14 d达到最大，随后由于发酵乳酸度逐渐升高，pH逐渐降低，乳酸菌对发酵乳内部的偏酸性环境的耐受能力有所下降，从而导致其活菌数略有降低［18］。在21 d时各组发酵乳的活菌数均能达到8 log cfu/mL以上，表明各组中的乳酸菌存活能力较强。

表3　发酵乳凝乳时间及4℃冷藏期间的活菌数变化Table 3　Changes in the viable counts of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.3发酵乳冷藏期间pH及滴定酸度的变化pH与酸度是发酵乳的一个重要指标，它与产品的口味、质地和风味有着密切的联系［19］。目前发酵乳发酵终点的判断主要是根据产品所达到的pH与酸度来决定，以酸奶为例，当pH达到4.5，滴定酸度达到70～90°T就结束发酵，开始降温在低温下成熟。

图8　发酵乳4℃冷藏期间pH的变化Fig.8　Changes in pH value of fermented milk during 4℃cold storage

图9　发酵乳4℃冷藏期间滴定酸度的变化Fig.9　Changes in titratable acidity of fermented milk during 4℃cold storage

由图8和图9可以看出，5组发酵乳在4℃冷藏21 d期间，其pH随天数增加而降低，滴定酸度随天数增加而升高。YO-MIX组发酵乳pH要高于其他组，而滴定酸度低于其他组。K4和K12发酵乳在冷藏期间pH降低及滴定酸度升高的趋势要大于其他组，这可能是由于藏灵菇中的乳酸菌种类相对复杂，乳酸菌生长代谢过程中产生了较多的有机酸，从而加速了牛乳的酸化。21 d时，由藏灵菇和商业发酵剂混合制备的发酵乳YO-K4和YO-K12的pH和滴定酸度差异不显著（p＞0.05），其pH高于K4和K12发酵乳，而滴定酸度低于K4和K12发酵乳。此外，在1 d时，K4和K12发酵乳的pH和滴定酸度存在显著差异（p＜0.05），表明不同来源藏灵菇的发酵能力存在差异。

2.6.4发酵乳冷藏期间持水力的变化持水力是反映发酵乳组织状态的重要指标之一。由图10可以看出，随着冷藏天数的增加，各组发酵乳样品的持水力均呈现下降趋势。在1～14 d的冷藏期间，K4、K12、YO-K4和YO-K12发酵乳样品的持水力均显著高于（p＜0.05）只添加商业发酵剂的YO-MIX发酵乳样品。这可能是由于EPS和蛋白质之间发生了相互作用，促使3D网状结构形成，从而增加发酵乳的保水性，降低脱水收缩作用［20］。

图10　发酵乳4℃冷藏期间持水力的变化Fig.10　Changes in WHC of fermented milk during 4℃cold storage

2.6.5发酵乳冷藏期间黏度的变化由图11可以看出，K4、K12和YO-MIX组发酵乳的黏度随冷藏天数增加而稳定增长，在14 d达到最大值，但随后开始降低。Ramchandran［21］研究同样发现酸奶在冷藏后期的黏度有所下降，并推断其可能是由于重组的蛋白质基质提高了胶体的硬度，从而降低了胶体黏度。此外，YO-K4和YO-K12发酵乳的黏度在整个冷藏期间相对稳定，其黏度显著高于YO-MIX组，表明EPS可提升发酵乳的黏度。Mende等［22］将由嗜热链球菌ST-143代谢产生的EPS添加到酸奶中，发现该EPS可显著提高酸奶的黏度，并分析其可能是由于带负电的EPS可与乳中带正电的酪蛋白颗粒产生静电吸收作用，从而加强多糖—蛋白的网络结构。

图11　发酵乳4℃冷藏期间黏度的变化Fig.11　Changes in viscosity of fermented milk during 4℃cold storage

3　结论

本研究通过单因素实验分析，确定了藏灵菇样品发酵高产EPS的条件为：接种量7%～9%；发酵温度37℃；发酵时间12～18 h；脱脂乳浓度11%。利用高产EPS的藏灵菇K12与商业发酵剂YO-MIX混合发酵全脂乳制备发酵乳，凝乳时间为4.52 h，在4℃冷藏21 d期间，该发酵乳胞外多糖含量保持在50 mg/L左右，具有较高的持水力、黏度和活菌数。高产EPS藏灵菇发酵剂在发酵乳制品加工中具有重要的开发前景。

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Study on the factors affecting exopolysaccharide production by fermentation with Tibetan Kefir and its application

WANG Ji1，TIAN Zheng2，ZHAO Xiao1，CAO Yong-qiang1，YANG Zhen-nai1，*
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Shunxin Agriculture Co.，Ltd.，Beijing 101300，China）

Exopolysaccharides（EPSs）production by 15 Tibetan Kefir samples collected from different regions were measured by phenol-sulfuric acid method，and three of them（K4，K7 and K12）with high EPS yields were selected.By single factor test，the fermentation conditions were obtained as follows：inoculation rate of 7%for K7 and K12，9%for K4，fermentation time of 12 h for K12，18 h for K4 and K7，fermentation temperature of 37℃，skim milk concentration of 11%.The use of the Kefir samples K4 or K12 together with a commercial starter as a mixed starter in fermentation of whole milk showed that the combination of K12 and commercial starter gave the shortest coagulating time（4.52 h）.During the 21 d of storage at 4℃，the fermented milk produced from this starter combination contained EPS of about 50 mg/L and viable bacterial counts of over 8.20 log cfu/mL，maintaining higher water holding capacity and viscosity.

Tibetan Kefir；exopolysaccharides；fermented milk；lactic acid bacteria

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.032

2014－10－31

王辑（1986-），男，博士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail：wangji198644@163.com。

杨贞耐（1965-），男，博士，教授，研究方向：乳品加工及交叉学科的理论和应用，E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn。

北京市教委科研计划重点项目（KZ201310011011）；国家自然科学基金面上项目（31371804）。