板栗品种褐变度差异性及其多酚氧化酶活性的相关性研究

郑　龙，肖正东，王陆军，蔡新玲，傅松玲，*（.安徽农业大学林学与园林学院，安徽合肥30036；.安徽省林业科学研究院，安徽合肥3003）

板栗品种褐变度差异性及其多酚氧化酶活性的相关性研究

郑龙1，肖正东2，王陆军2，蔡新玲2，傅松玲1，*
（1.安徽农业大学林学与园林学院，安徽合肥230036；2.安徽省林业科学研究院，安徽合肥230031）

以37个板栗品种为试材，研究了板栗果实褐变差异性及其与多酚氧化酶（PPO）活性之间的关系，并根据褐变差异性对各品种进行聚类分析。结果表明：板栗不同品种间褐变差异显著（p＜0.05），根据褐变差异性聚类分析，可将37个品种可以分为5个等级；不同品种间PPO活性差异显著（p＜0.05）；通过探讨不同品种间褐变度与PPO活性的关系，发现随着板栗品种间PPO活性的升高，褐变度也开始升高，当PPO活性达到90 U·min-1·g-1时，PPO活性对褐变影响开始降低；通过褐变聚类分析，将板栗PPO活性分为5类，在优选或改良品种时，可将品种的PPO活性在第一或第二类活性范围以下作为选择依据之一。

褐变度，多酚氧化酶，相关性

板栗（Castanea mollissima Blume）属壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea）植物，其营养丰富，栗仁中含有人体必需的蛋白质、碳水化合物、脂肪和多种微量元素，是经济价值非常高的干果［1］。板栗在储藏和加工过程中，易产生褐变，会严重影响其外观、风味，降低产品质量。板栗的褐变主要有酶促褐变和非酶褐变［2］。酶促褐变主要是由栗仁中酶的作用引起的［3］，其中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是起主导作用的酶类。多酚氧化酶是大部分植物中都存在的含Gu元素的氧化还原酶，参与呼吸末端氧化还原反应［4-5］，易催化各种酚类（儿茶酚等）使之氧化成醌，从而进一步氧化成黑色素［6］，PPO活性受多基因控制，在2D、2A、2B、3B、6D染色体上都含有与其相关的染色体［7］。在食品加工过程中，预防多酚氧化酶褐变的方法有很多，主要方法是使PPO失活［8-11］。为了抑制板栗的褐变，人们一直都在探索改变其加工工艺或者利用不同的pH、温度来抑制PPO活性［12-13］。缺乏对相关板栗品种资源PPO活性差异情况的研究，使得具有针对性的板栗品种遗传改良无法有效的展开。可以利用褐变颜色的深浅与PPO活性的关系进行比较，探索两者的关系［14］，并将板栗的PPO活性进行聚类分析，从而将板栗品种进行分类，筛选优良抗褐变品种。本研究测定了37个板栗品种的PPO活性分布规律及其与褐变的关系，为板栗品种优选或者品质改良提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

37个品种板栗（表1） 包括河北、北京引进品种16个，安徽省内品种21个，其中‘全椒1号’、‘全椒2号’、‘全椒3号’三个品种种植于滁州市全椒县，‘南谯1号’、‘南谯2号’、‘南谯4号’、‘南谯5号’四个品种种植于滁州市南谯区，其余品种于滁州沙河林木良种繁育中心统一种植，所有板栗品种于同一年度果实完全成熟时收集（即栗苞由绿色转为黄褐色，并开裂成十字裂口）；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、PEG（聚乙二醇）、邻苯二酚、磷酸二氢钠（磷酸缓冲液） 药品均来自于合肥美丰化工仪器有限公司。

WB-2010水浴锅天津奥特赛斯仪器有限公司；UV-7502CS分光光度计上海欣茂仪器有限公司；HC-3515高速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；FA2004分析天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

表1　供试板栗品种Table 1　List of the Castanea mollissima varieties

1.2实验方法

1.2.1多酚氧化酶活性测定称取板栗仁10 g，加入少许含1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和1%PEG（聚乙二醇）的0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.5），研磨成匀浆，然后用缓冲液定容至50 mL，将匀浆液在4℃左右以5000 r/min的速度离心10 min，离心后取上清液即为粗酶液，置于4℃冰箱保存。

取1 mL酶液和2 mL 100 mmol/L的邻苯二酚于30℃水浴预热5 min，混合后，用分光光度计在410 nm波长下测定5 min内吸光值的变化，以邻苯二酚加蒸馏水的自然氧化作对照［12］。在室温下，每克酶液每分钟吸光值上升0.001定义为1个酶活性单位（U），PPO活性为△A·103（U·min-1·g-1，△A为5 min内的吸光度变化值），重复3次。

1.2.2板栗褐变测定将新鲜板栗脱壳去衣，洗净沥干后，用不锈钢刀将板栗切碎，称取2份2.5 g的样品，加适量磷酸缓冲液（pH5.8），研磨，再定容至25 mL，一份在在4℃下离心（3000 r/min）5 min，取上清液置于30℃水浴锅中20 min，用分光光度计测定420 nm下吸光值，测得的数据为褐变初始值。另一份25 mL溶液置于4℃冰箱中3 d后，取出离心（3000 r/min）5 min，取上清液置于30℃水浴锅中20 min后，在420 nm下吸光，测得的数据为褐变终值。每处理3次重复［14］。

1.2.3统计方法测定重复3次，分别平均取样，结果以平均值计算，实验数据用Microsoft Excel数据处理系统进行处理，用数据统计软件SPSS 19.0进行方差分析和聚类分析（聚类所用数据是PPO活性变化值）。

2　结果与分析

2.1板栗品种褐变度差异

从测定结果看（表2），不同品种的板栗褐变度有很大差异，在30℃褐变20 min的情况下，初始褐变度变化幅度为0.128～0.172，变幅范围为0.044，变幅范围较小，品种间差异小。说明板栗品种间在初始褐变时，褐变度差异较小。

在4℃褐变3 d的条件下，褐变度终值变化幅度为0.284～0.751，变幅范围为0.467，变动幅度较大，种间差异性显著。与初始褐变相比，褐变终值的差异较大。说明板栗品种褐变随着时间延长，褐变度差异逐渐变大。褐变变化值从0.151～0.600，变幅范围为0.449，变动幅度较大，差异性显著（p＜0.05）。

分析表2中数据发现，板栗的褐变程度是随着时间延长而加深的，在研究板栗品种的抗褐变能力时，需将初始褐变值、终褐变值和褐变变化值三者结合，综合分析，才能正确评价品种的抗褐变能力，如表2中的1号（黑山寨7号）品种，其初始褐变度、终褐变度以及变化值都较小，抗褐变能力较高，而37号（阳光2号）品种，其初始褐变度较低，而其终测褐变度却很高，说明其褐变速度较快，抗褐变能力较低。

2.2板栗品种PPO活性差异

板栗品种PPO活性变异区间为8.53～149.48 U· min-1·g-1，变幅范围为140.95 U·min-1·g-1。PPO活性主要集中在30～70 U·min-1·g-1之间，占整体的62%，呈偏态性，高活性品种和低活性品种数量较少，品种间差异显著（p＜0.05）（表2），说明板栗品种间PPO活性变化幅度很大，而由于PPO活性是板栗褐变的主要影响因子，PPO活性的差异必定会对板栗的褐变程度产生影响。

2.3板栗褐变与PPO活性相关性分析

通过分析板栗的PPO活性与其褐变初始值、终值以及变化度的相关性（表3），发现板栗PPO活性与其褐变度成正相关关系。其中PPO活性与其褐变度变化值相关性最大，与初始值相关性最小。说明在具体分析PPO活性与褐变关系时，可以利用PPO活性与褐变变化值来进行分析。

表2　不同板栗品种的褐变度和PPO活性Table 2　Browning degree and PPO activity of Castanea mollissima varieties

表3　板栗褐变与PPO活性相关性分析Table 3　Correlation analysis of Castanea mollissima browning and PPO activity

通过图1板栗品种的褐变度变化值与其PPO活性比较，发现随着板栗的褐变度的增大，PPO活性整体呈上升态势，板栗的PPO活性与其褐变度整体呈正相关。只有部分板栗品种PPO活性较大，但其褐变度却较小。在PPO活性小于20 U·min-1·g-1时，板栗褐变程度变化较小，在PPO活性超过20 U·min-1·g-1时，随着其活性增高，褐变的变化值开始加快，当PPO活性超过90 U·min-1·g-1时，PPO活性与褐变度的关系开始不太明显，但整体仍呈上升态势。这说明PPO活性影响着板栗的褐变度，活性越高，褐变度越大。

图1　板栗品种PPO活性与褐变变化值Fig.1　PPO activity and browning degree of Castanea mollissima varieties

2.4板栗PPO活性聚类结果分析

板栗37个品种的PPO活性不同，利用PPO活性进行聚类分析，从分析结果看（图2），在聚类分为两类时，1～31号品种作为一类，32～37号品种为第二类；分为四类，分类结果为，第一类1～20（18号除外）号，第二类18、21～31号，第三类32、34、36号，第四类为33、35、37号；分为五类，分类结果为，第一类1～5号，第二类6～20（18号除外）号，第三类18、21～31号，第四类为32、34、36号，第五类为33、35、37号。

图2　板栗品种聚类分析树形图Table 2　Cluster analysis dendrogram of Castanea mollissima varieties

在几种分类结果中，分为5类时，各类数量较为均衡，较为合理，与其他几种分类方式相比，能更有效地将PPO活性进行区分。因此，各类PPO活性范围为，第一类PPO活性为8.53～22.63 U·min-1·g-1，第二类26.46～45.61 U·min-1·g-1，第三类53.24～71.89 U·min-1·g-1第四类94.20～113.30 U·min-1·g-1，第五类125.78～149.48 U·min-1·g-1。通过分类，不同类别褐变度都各自有一定的各自区间和重叠，说明PPO活性高低对板栗褐变起到了主要作用，随着活性增高，抗褐变能力越弱，但是其中也受到了其他底物的影响，随着PPO活性达到一定程度，对褐变的影响能力开始降低。

由此，发现1～5号褐变度变化小，为抗褐变能力强的品种，即‘黑山寨7号’、‘全椒3号’、‘燕红’、‘河北尊玉’、‘阳光3号’；而6～17、19～20号为较抗褐变品种；18、21～31号品种褐变变化程度中等；其余品种抗褐变能力弱。

3　结论与讨论

3.1将不同板栗品种在相同的环境下进行褐变实验，并在420 nm下测量其吸光值，可有效考察不同品种的抗褐变能力，选取抗褐变的板栗品种。对于抗褐变能力不强的品种，在板栗加工过程中，为了防止其褐变，需要做更多的处理，或者辅助添加剂，从而增强抗褐变能力。通过本实验可大致将板栗抗褐变品种的褐变的变化值规范在420 nm下吸光变化值在0.35以下。

3.2在测量板栗PPO活性实验中，以邻苯二酚为底物，在420 nm下测量5 min吸光度变化值，使各品种间变幅增大［15］，特别是对于高PPO活性的板栗品种，可使其分辨率有效提高，从而利于区分不同褐变程度的板栗的PPO活性。PPO活性影响着板栗的褐变，其褐变度整体随着板栗的PPO活性增大而增大，在进行板栗抗褐变品种优选或者品种改良时，需要将其PPO活性控制在第一类或者第二类范围以下，即至少在45.61 U·min-1·g-1以下，从而保证其在加工或者储藏中保持良好的品质。

3.3板栗品种的整体PPO活性差异很大，如本研究中最高的PPO活性可达149.48 U·min-1·g-1，对于PPO活性高的品种，将对其加工产品的品质造成较大的影响，另外，板栗PPO活性受环境影响很大，储藏时间不同、不同外界环境因子或者处理方法等都会使得PPO活性产生差异。因此，为了进一步了解板栗褐变与PPO活性的差异，以便更好地进行品种优选和对已有品种进行改良，需要在未来进一步研究相关的分子鉴定技术。对于此方面的研究，可以借鉴对小麦的PPO活性分子鉴定的研究，确定影响PPO活性的基因的染色体［16-17］，利用相应的分子标记区分高低PPO活性等位基因，采用PCR技术判断PPO活性对褐变的影响［18-20］。

［1］王向红.不同品种板栗的营养价值和品质分析［J］.食品科技，2004（2）：95-97.

［2］康明丽，牟德华.板栗加工褐变机理及防控方法进展研究［J］.河北科技大学学报，2003（24）：72-74.

［3］周家华，常虹.板栗多酚氧化酶的酶学特性［J］.食品研究与开发，2010（2）：91-94.

［4］张宪政，陈凤玉，王荣富.植物生理学实验技术［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1994：94-97.

［5］Park W J，Shelton D R，Peterson C J，et al.Variation in polyphenol oxidase and quality characteristics among hard white wheat and hard red winter wheat sample［J］.Cereal chem，1997，74（1）：7-11.

［6］帅玉忠，蒋世云，刘光东.荔枝多酚氧化酶动力研究［J］.山西食品工业，1999（2）：2-4.

［7］Demeke T，Morris C F，Campbell K G，et al.Wheat analytical polyphenol oxidase distribution and genetic mapping in three inbred line populations［J］.Crop Science，2001，41：1750-1757.

［8］YI Jianyong，JIANG Bin，ZHANG Zhong，et al.Effect of ultrahigh hydrostatic pressure on the activity and structure of mushroom（Agaricus bisporus）polyphenoloxidase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（2）：593-599.

［9］LIU Wei，LIU Jianhua，XIE Mingyong，et al.Characterization andhigh-pressuremicrofluidization-inducedactivationof polyphenol oxidase from Chinese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（12）：5376-5380.

［10］LIU Wei，LIU Jianhua，LIU Chengmei，et al.Activation and conformational changes of mushroom polyphenol oxidase by high pressure microfluidization treatment［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：142-147.

［11］YANG Zhenfeng，CAO Shifeng，CAI Yuting，et al. Combination of salicylic acid and ultrasound to control postharvest blue mold caused by Penicillium expansum in peach fruit［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2011，12（3）：310-314.

［12］曾婷婷，张立彦，芮汉明.板栗的酶促褐变特性及灭酶预处理研究［J］.食品工业科技，2011（10）：110-113.

［13］周丹，李颍佳，王建中.板栗酶促褐变过程中多酚氧化酶和过氧化物酶活性的变化［J］.食品科技，2014，39（6）：47-50.

［14］李山云，隋启君，白建明，等.抗机械损伤褐变马铃薯品种（系）的筛选［J］.中国马铃薯，2010，24（4）：193-196.

［15］杨朝柱，马传喜，司红起，等.普通小麦多酚氧化酶活性的变异［J］.中国农业科学，2004，37（11）：1713-1717.

［16］张立平，葛秀秀，何中虎，等.普通小麦多酚氧化酶活性的QTL分析［J］.作物学报，2002，31（1）：7-10.

［17］孙家柱，赵军涛，刘冬成，等.小麦籽粒多酚氧化酶（PPO）检测的方法的优化及其在育种中的应用［J］.麦类作物学报，2012，32（3）：448-453.

［18］孙道杰，何中虎，王辉，等.小麦籽粒PPO活性分子标记研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2006，34（9）：149-156.

［19］He X Y，He Z H，Morris C F，et al.Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxidase genes in common wheat and related species［J］.Genetic Rosources and Crop Evolution，2009，56：311-321.

［20］He X Y，He Z H，Morris C F，et al.Allelic wariation of polyphenol oxidase（PPO）genes located on chromosome 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，115：47-58.

Study on the relationship between the browning and polyphenol oxidase activity of Castanea mollissima

ZHENG Long1，XIAO Zheng-dong2，WANG Lu-jun2，CAI Xin-ling2，FU Song-ling1，*
（1.School of Forestry and Landscape Architecture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.Anhui Acaademy of Forestry，Hefei 230031，China）

In this study，37 Castanea mollissima cultivars were used to study the relationship between the activities and Castanea mollissima browning differences and polyphenol oxidase（PPO），and according to the cluster analysis browning differences of all varieties.The results showed that the browning of different virities was significantly（p＜0.05）different according to the cluster analysis of browning differences.37 varieties could be divided into 5 levels.The differences of PPO activity between cultivars were significantly.By comparison between varieties of degree the browning and PPO activity increased with the Castanea mollissima varieties，it was found that PPO activity，browning degree were beginning to rise，When PPO activity reached 90 U·min-1·g-1，PPO activity against browning began to decrease by clustering the Castanea mollissima browning，the activities of PPO were divided into 5 categories.When Castanea mollissima preferred or improved varieties，PPO activity varieties could be in the first or second activity of the range that choose one of the following as the basis.

the degree of browning；polyphenol oxidase；correlation

TS201.2

A

1002-0306（2015）18-0126-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.017

2015－01－06

郑龙（1988-），男，硕士研究生，研究方向：园林植物与观赏园艺，Email：zhenglong4150@126.com。

傅松玲（1962-），女，教授，研究方向：森林培育教学及研究，Email：fusongling@ahau.edu.cn。

林业公益性行业科研专项（201104025－3）。