CYP17基因多态性与大同地区早期复发性自然流产关系研究

穆雅琴，朱壮彦，王 健，席国萍，齐彩霞，赵富玺

（山西大同大学免疫学研究所，山西大同037009）

CYP17基因多态性与大同地区早期复发性自然流产关系研究

穆雅琴，朱壮彦，王 健，席国萍，齐彩霞，赵富玺*

（山西大同大学免疫学研究所，山西大同037009）

目的探讨CYP17基因多态性与大同地区早期复发性自然流产的关系。方法采用PCR-RFLP分别检测山西大同地区的不明原因早期复发性自然流产（58例）和健康妊娠妇女（73例）的CYP17基因多态性，分析探讨两者的关系。结果早期复发性自然流产组和对照组之间CYP17 3种基因型分布具有统计学意义（χ2=7.817，P=0.020）。A2/A2、A1/A2发生早期复发性自然流产的危险度分别提高了3.181倍和3.123倍。结论CYP17等位基因突变可增加发生早期复发性自然流产的危险性，可能是早期复发性自然流产的遗传易感因素之一。

早期复发性流产；CYP17基因多态性；PCR-RFLP

早期复发性自然流产（recurrent pregnancy loss，RPL)主要指妊娠12周以前连续发生2次或2次以上的自然流产[1]。导致自然流产发生的原因非常复杂，已有研究表明自然流产的发生与女性患者的染色体异常、子宫解剖结构异常、内分泌异常、免疫因素、感染因素、不良生活习惯及男性伴侣因素等有关，但仍有部分病例的发生机制仍不明了[2]。

近来有研究表明，复发性自然流产的发生与某些基因的多态性有关。细胞色素P450 17（cyto⁃chrome P45017，CYP17）基因位于10号染色体长臂24.3区，主要编码细胞色素P450 17α酶，该酶是类固醇激素合成的限速酶之一，在雌激素的合成中发挥重要作用。CYP17基因5’上游34bp处有对限制性内切酶MSP A1Ⅰ敏感的多态性位点，该位点的碱基存在T/C多态性，形成A1/A2两个等位基因，不同等位基因的表达水平在一定程度上影响着体内雌激素的水平[3-4]。

鉴于此，本研究拟采用聚合酶链反应－限制性片断长度多态性方法（PCR-RFLP），探讨CYP17基因MspA1Ⅰ酶切位点基因多态性与人类早期复发性自然流产的关系。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

本研究对象选自大同市及其周边地区医院2008-2013年门诊及住院患者，不明原因的早期复发性自然流产58例，健康妊娠妇女73例。正常组健康孕妇中位年龄28.3±2.1岁，平均孕周为8.5±2.6周，B超证实胎儿发育正常，既往无自然流产、宫内死胎和妊娠期高血压疾病等不良妊娠史的发生。实验组早期RPL孕妇中位年龄为27.6±3.2，平均孕周为9.2±1.7，已排除染色体、子宫解剖结构、内分泌、免疫、感染、男性因素及不良生活习惯等因素影响。实验组和对照组之间年龄、孕周等一般资料无统计学差异。本研究所有对象均签署知情同意书，符合医学伦理学的相应要求。

1.2 主要实验试剂和仪器

MSP A1Ⅰ限制性内切酶购自加拿大BBI公司，血液基因组DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司，微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒来自康为世纪生物科技有限公司。主要仪器有ABI 9700普通PCR扩增仪（美国ABI公司）、电泳仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）、化学发光成像分析系统（美国伯乐生命医学产品有限公司）、台式高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心仪器有限公司）、Milli-Qplus超纯水装置（美国Millipore公司）等。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA

取空腹取外周静脉血3 mL，经柠檬酸钠抗凝后，Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。应用紫外分光光度计检测A260/A280比值，比值在1.7～1.9之间即所提取DNA的纯度符合实验需求，同时采用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.3.2 CYP17基因多态性检测

采用PCR-RFLP法对CYP17基因多态性进行检测。上游引物为5'-TCC TGA GCC CAG ATAC⁃CA T-3'；下游引物为：5'-CCG CCC AGA GAA GTC CT-3'，扩增产物为626bp[5]。反应体系包括10 × Taq Buffer with KCl 5 μL，dNTP 1 μL，MgCl24 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 33.8 μL，共50 μL。热循环参数为 95℃ 5 min，然后94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 30s，进行35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳，化学发光成像分析系统观察并拍照，在626bp处出现条带即为扩增出的CYP17。取PCR产物8 μL、酶切buffer 5 μL、酶 0.2 μL、ddH2O 36.8 μL，共 50 μL 酶切体系，37℃水浴过夜。酶切产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳30 min，在化学发光成像分析系统观察酶切图谱判定基因型并拍照。

1.4 统计学方法

本研究的实验数据以±s或阳性率（%）表示。所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，计数资料组间基因型差异的比较采用χ2检验进行分析，计量资料采用t检验分析，以P=0.05为检验水准。同时用比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（95%confidence interval，95%CI）确定CYP17 基因多态性对于早期复发性自然流产的相对危险度。

2 结果

2.1 基因组DNA检测结果

模板DNA经PCR扩增后，通过2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，见图1。

图1 CYP17基因扩增产物电泳图

2.2 CYP17基因型MspA1Ⅰ酶切位点多态性分析

扩增后DNA片段的长度为626bp，在MspA1Ⅰ酶切位点切割后，选择3.0%琼脂糖凝胶进行电泳并分析结果。没有MspA1Ⅰ酶切位点的纯合基因型A1/A1（野生型）不能被MspA1Ⅰ酶内切，其电泳结果只有626bp条带；有MspA1Ⅰ酶切位点的纯合基因型A2/A2（突变型）则被切为2条小条带；杂合基因型A1/A2的双链DNA中只有1条具有Ms⁃pA1Ⅰ酶酶切位点，故可出现3条条带，见图2。

图2 CYP17基因扩增产物MspA1Ⅰ酶切后电泳图

2.3 CYP17基因型MspA1Ⅰ酶切位点多态性和早期复发性自然流产的相关性分析

本研究结果显示，早期复发性自然流产组和对照组之间，CYP17基因型A1/A1、A1/A2、A2/A2的分布有差异，且有统计学意义（χ2=7.817，P=0.020）。与野生基因型A1/A1相比，纯合突变基因型A2/A2、杂合基因型A1/A2发生早期复发性自然流产RPL的危险度分别提高了3.181倍和3.123倍。等位基因C,T在2组之间的分布差异有统计学意义，突变基因A2使发生早期自然流产的危险度升高了1.673（1.022 ～ 2.739）倍。见表1，表2。

表1 早期复发性自然流产组和对照组CYP17多态性基因型频率

表2 早期复发性自然流产组和对照组CYP17基因多态性等位基因频率

3 讨论

早期复发性自然流产的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。随着近年来自然流产发生率的升高，关于复发性自然流产的遗传易感性越来越受到学者们的关注，成为生殖医学研究的热点之一。CYP17基因主要编码细胞色素P450 17 a酶，该酶具有17a羟化酶和17,20裂解酶的双重作用，前者可将孕酮羟化为17a羟孕酮，后者可继续催化17a羟孕酮为雄烯二酮，继而转化为雌激素。人类CYP17基因存在单核苷酸多态性位点，CYP17等位基因突变可影响其编码的细胞色素P450-17a酶的转录和翻译的过程，进而影响雌激素的产生[6]。

日本学者Sata[5]的研究证实携带有CYP17基因A2等位基因的女性发生RSA的风险增加，携带有A2/A2纯合突变基因型的RSA患者，较携带有A1/A1纯合野生型者其发病风险增加2.37倍。本研究结果也表明，与野生基因型A1/A1相比，纯合突变基因型A2/A2、杂合基因型A1/A2发生早期复发性自然流产的危险度明显增高。

其可能的原因是由于CYP17基因rs743572（T→C）多态性位点中T→C等位基因的突变，增强了CYP17基因的转录效率，产生大量雌激素的同时却使孕酮的表达水平降低。而孕酮在妊娠的过程中对于胚胎的发育起着非常重要的作用，特别是早期妊娠的维持需要足够量的孕酮，已有研究表明，妊娠期孕酮量水平低下时会引发先兆流产或难免流产[7]。与此同时，高剂量的雌激素通过与雌激素受体结合，可介导细胞膜内外信号转导，从而促进胚胎及子宫内膜细胞增殖，增加胚胎DNA突变的可能性[8]。故CYP17基因等位突变可通过激素水平的变化影响早期胚胎的发育，导致早期复发性自然流产的发生。本研究组认为CYP17突变基因型可能是RPL患者的危险因素之一，携带有CYP17A2等位基因的人群发生早期复发性流产的几率明显升高。故在临床治疗中可针对易感人群采用激素替代疗法，纠正其体内的孕酮水平，从而降低早期复发性自然流产的发生率。

[1]Smith M L，Schust D J.Endocrinology and recurrent early pregnancyloss[J].Semin Reprod Med,2011,29(6):482-490.

[2]Rai R,Regan L.Recurrent miscarriage[J].Lancet，2006,368(9535):601-611.

[3]Ohnishi T,Ogawa Y,Saibara T,et al.CYP17 polymorphism as a risk factor of tamoxifen-induced hepatic steatosis in breast Cancer⁃patients[J].Oncol Rep,2005,13(3):485-489.

[4]张丽娜,钱碧云,陈可欣，等.CYP17基因多态性与天津汉族女性散发乳腺癌风险关系的研究[J].中国肿瘤临床,2008,35(9):530-533.

[5]Sata F,Yamada H,Yamada A,et al.A polymorphism in the CYP17 gene relates to the risk of recurrent pregnancy loss[J].Mol Hum Reprod,2003,9(11):725-728.

[6]Auchus R J,Lee T C,Miller W L.Cytochrome b 5 augments the 17,20-lyase activity of human P450c17without direct electron transfer[J].J Biol Chem,1998,273(6):3158-3165.

[7]龙凤宜,范江涛,李建华，等.血清孕酮,IL-8,TNF-α在先兆流产中的意义[J].实用妇产科杂志,2006，22(2):92-94.

[8]Setiawan V W,Schumacher F R,Haiman C A,et al.CYP17 genetic variation and risk of breast and prostate cancer from the Nation⁃al Cancer Institute Breast and Prostate Cancer Cohort Consortium(BPC3)[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(11):2237-2246.

〔责任编辑 杨德兵〕

Study on the Relationship between Polymorphisms of Genes CYP17 and Early Recurrent Pregnancy Loss in Datong Region

MU Ya-qin,ZHU Zhuang-yan,WANG Jian,XI Guo-ping,QI Cai-xia,ZHAO Fu-xi*
(Institute of Immunology，Shanxi Datong University，Datong Shanxi,037009)

Objective To investigate the relationship between polymorphisms of CYP17 involved in early recurrent pregnancy loss.Methods PCR-RFLP was used to detect the MspA1Ⅰpolymorphism of CYP17 in a case-control study including 58 cases of RPL and 73 cases as controls.Results There was a significant difference in the frequencies of genotypes A1/A1，A1/A2，A2/A2 in CYP17 MspA1Ⅰbetween two groups（χ2=7.817，P=0.020）.Compared with wild-type A1/A1，the susceptibility of RPL with muta⁃tional genotypes of A2/A2 and A1/A2 was increased by3.181 and 3.123 respectively.Conclusion The gene polymorphism of CYP17 MspA1Ⅰhas correlation with early RPL risk from Datong population.Mutational CYP17 genotypes may increase the risk of recurrent abortion，and might be one factor of the genetic susceptibility of early RPL.

early RPL；CYP17 gene polymorphism；PCR-RFLP

R714.21

A

1674-0874(2015)03-0040-03

2015-01-23

国家自然科学基金项目[81170621/H0425]；山西省青年科学基金项目[2010021036-4]；国家人口计生委项目[C-73]

穆雅琴（1980-），女，山西原平人，硕士，讲师，研究方向：生殖免疫；*赵富玺，男，博士，教授，通信作者。