促排卵大鼠子代模型的建立

顾欣贤　胡春洪★

促排卵大鼠子代模型的建立

顾欣贤胡春洪★

目的 建立使用促排卵药物后受孕大鼠的子代模型。方法 分别采用20IU、40IU的马血清促性腺激素（PMSG）及人绒毛膜促性腺激素（HCG）对雌性未交配性成熟SD大鼠（7～8周龄）进行超数排卵，并与雄鼠合笼。对照组雌鼠用相同剂量的生理盐水腹腔注射，并与雄鼠合笼。比较其子代出生的时间、个数、体重，分析促排卵模型是否成功；通过平面翻正实验（出生1周时进行）和转动杆实验（出生3周时进行）检测子代大鼠的新生反射和行为能力。结果 各组雌鼠均在合笼后20～22d生产。对照组子代大鼠出生个数（9±1.5）个，体重（8.5±0.4）g。20 IU组子代大鼠出生个数（11±1.2）个，体重（8.2±0.3）g。40 IU组子代大鼠出生个数（16±4.2）个，体重（7.6±0.25）g。各组大鼠在平面翻正实验和转动杆实验中表现无显著差异（P＞0.05）。各组雌鼠孕期无显著变化；20IU组与对照组子代大鼠个数之间比较无明显差异性（P＞0.05）；40IU与对照组子代大鼠个数之间差异有显著性（P＜0.01），其效果显著优于20IU组（P＜0.05），说明8周龄大鼠促排卵子代模型的有效剂量为40IU；子代大鼠在新生反射和行为能力方面无显著差异（P＞0.05）。结论 利用PMSG促排卵后的大鼠，通过产下的子代来作为人类促排卵后受孕后代的模型。

马血清促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素 SD大鼠

辅助生育技术的不断进步，为越来越多的不孕不育患者带来了希望，排卵异常造成的不孕不育比例高达25%～30%，因此促排卵药物较广泛的应用于辅助生育中。目前已有不同剂量马血清促性腺激素（PMSG）对大鼠超排卵效果与质量的研究［1～3］，但对于促排后大鼠受孕情况及子代的研究甚少。本资料自2014年3月至6月拟构建促排卵大鼠的子代模型，以探索促排卵受孕大鼠子代的中枢神经系统的结构及功能发育的特点，为了解促排卵药物对子代的远期影响，预测药物对子代出生后神经系统结构发育及行为能力的影响奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物 健康雌性及雄性未交配性成熟SD大鼠各18只，鼠龄7～8周饲养条件无特定病原体（SPF）级别，自由摄食饮水，每天光照时间7：00～19：00，照明12h/d，温度22～26℃，相对湿度60%～80%，雌雄分笼饲养。

1.2试剂 PMSG（上海高创化学科技有限公司 HOR-272）；人绒毛膜促性腺激素（HCG）（上海高创化学科技有限公司HOR-250）。

1.3实验方法 （1）实验动物：提前1周购买雌鼠18只+雄鼠18只，按SPF级别动物饲养规范饲养及观察大鼠的生活状态，直至雌雄鼠熟悉新的生活环境，随机分为3组，每组3对（6只雌鼠+6只雄鼠），均在每天上午7：30～8：30行阴道涂片、染色及镜检，涂片发现进入排卵后当天下午16：00，随机选取一组进行腹腔内注射PMSG 40IU，一组进行腹腔内注射PMSG 20IU，48h后两组分别再次注射等量HCG。剩余一组于同时间点腹腔内注射1ml生理盐水。将注射PMSG与HCG的两组雌鼠与雄鼠合笼，每笼2只（1只雌鼠+1只雄鼠），分别标记40与20作为观察组，注射等剂量生理盐水的雌鼠与雄鼠合笼后标记为对照组，每笼2只。由于SD大鼠的孕期在21d左右，因此按照SPF饲养规范，自由摄食饮水，每天光照时间为7：00～19：00，照明12h/d，温度22～26℃，相对湿度60%～80%，继续饲养≥21d，直至子代大鼠出生，将雄鼠与雌鼠分笼。（2）平面翻正实验：子代大鼠出生1周时，进行平面翻正实验。将子代大鼠四肢向上仰面置于一木质平面上，记录其从仰面至完全翻正（以四肢全着地为标准）所需时间，观察大鼠由翻转状态转为正常体位的能力。评分标准：0分：30s内未翻转。1分：20～30s内翻转。2分：10～20s内翻转；3分：10s内翻转。（3）转动杆实验：子代大鼠出生1周时，进行转动杆实验。将子代大鼠置于表面光滑的转杆上，观察大鼠在转杆上的行走能力。评分标准：0分： 转动开始前，鼠从杆上掉下。1分：转动开始后，鼠从杆上掉下。2分：转动过程中，≥60s时间，鼠未掉下。3分：转动过程中，鼠可在杆上行走。

2　结果

2.1促排卵模型建立 各组雌鼠均在合笼后20～22d生产，孕期无显著变化。对照组子代大鼠出生个数为（9±1.5）个，体重为（8.5±0.4）g。20 IU组子代大鼠出生个数为（11±1.2）个，体重为（8.2±0.3）g。40 IU组子代大鼠出生个数为（16±4.2）个，体重为（7.6±0.25）g。20IU组与对照组子代大鼠个数之间比较无明显差异（P＞0.05）；40IU与对照组子代大鼠个数之间差异有显著性（P＜0.01），其效果显著优于20IU组（P＜0.05），说明40IU是8周龄大鼠促排卵模型有效且安全的剂量。40IU与对照组比较，子代大鼠的体重差异无统计学意义（P＞0.05），但有下降趋势，这可能是由于子代大鼠数量多造成的。

2.2促排卵对子代大鼠行为学的影响 分别在出生1、3周时，进行大鼠平面翻正实验和转动杆实验，检测子代大鼠的新生反射和行为能力。各组大鼠的新生反射和行为能力均无明显差异（P＞0.05）。见表1、2。

表1　子代大鼠平面翻正实验（只）

表2　子代大鼠转动杆实验（只）

3　讨论

有关于wistar大鼠，C57BL/6J小鼠，小鼠的超排卵的研究报道，但是SD大鼠此方面的报道较少。SD大鼠平均寿命2.5～3年，一般0～2个月为幼年期，2～20个月为成年期，20个月后为老年期。因此一般大鼠的超排卵多选择8～9周龄的大鼠。但是较多方法均不能引起成年大鼠的有效超排卵，常存在超排卵数量少，超排卵不整齐等一系列问题。这可能是由于处于不同发情周期的大鼠对激素的感应性不同造成的［1，2］。因此大鼠的周龄及激素剂量的选择对于造模起着重要的作用。

3.1大鼠周龄的选择 随着年龄的增长，大鼠体内的雌激素水平亦发生变化，体内激素水平的不同使其对外来激素的感应性也不同。文献报道［1］，在对SD大鼠进行超排卵的实验中，SD大鼠的超排卵效果随着年龄增长而下降，与6～7周龄大鼠和8～10周龄大鼠这两组大鼠比较，4～5周龄组大鼠的超排卵数明显增高，因此认为年龄是影响SD大鼠超排卵效果的重要因素。由于大鼠一般在2个月龄达到性成熟，4～5周龄的大鼠并未具备孕育子代大鼠的能力，因此在本实验中，大鼠的周龄选择在7～8周龄。

3.2试剂及剂量的选择 PMSG具有类似FSH（卵泡刺激素）和LH（黄体生成素）的双重活性，但以FSH的作用为主，因此有着明显的促卵泡发育的作用，同时有一定的促排卵和黄体形成的功能。PMSG是一种经济实用的促性腺激素。由于其可靠的超排卵效果，广泛应用于哺乳动物的超数排卵。在生产上常用以代替较昂贵的FSH而广泛应用于动物的诱发发情、超数排卵或增加排卵率（如提高双羔率）；对卵巢发育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定疗效。

有研究发现［3］，对于4～5周龄的大鼠，当激素剂量为20IU/只时超排卵数最多，平均每只可收集卵子50枚左右，继续增大激素剂量并未引起更多的超排卵数。但在7～8周龄的大鼠进行超排卵时，40IU/只可获得比20IU/只更好的超排卵效果，达到32.7枚［3］，因此本资料中选择20IU和40IU两种剂量进行超排卵。

3.3本实验的意义 本实验中，雌性大鼠促排卵后与雄鼠合笼，常规饲养，发现其在合笼后20～22d产下子代，基本符合大鼠孕期21d的生理周期。40IU组的子代大鼠个数明显高于20IU组和对照组，可见PMSG的促排卵具有效果，增加了子代大鼠的个数。但是文献报道，对于8周龄的大鼠40IU的PMSG可使其促排卵达32.7枚，本实验中子代个数明显小于这个数字。在实践中利用PMSG进行诱发发情或超数排卵处理时，发现动物个体对PMSG的反应性差异较大，有的个体甚至无反应。其原因比较复杂，有研究认为可能是由于PMSG会影响雌性动物的生殖道内环境，也可能是个体生理状态不同，或者不同个体产生不同程度的免疫性反应所致，这些因素均不利于受精卵的发育和妊娠［4］。近几年研究认为，利用PMSG超排卵后，雌性动物体内的雌二醇-17β水平会增高，其可以刺激输卵管的运动性，因此加速了胚胎的迁移，使胚胎过早暴露于不适合其发育的内环境，造成胚胎的大量丢失［5］。有研究者在大鼠上亦发现了相似的现象［6］，还有研究认为，高剂量的PMSG可能对卵子质量有害，比如受精能力、发育能力及染色体的异常［7～9］。已有研究表明，仓鼠经超排卵处理所得的胚胎在移植后发育能力下降［10］。因此本实验中，子代大鼠的数量明显小于相同剂量相同周龄大鼠促排卵的数量。

综上所述，虽然PMSG具有较好的促排卵效果，但其本身也存在降低卵子质量，影响受精能力，降低胚胎生存能力等方面的问题。因此利用PMSG促排卵后的大鼠，通过产下的子代来作为人类促排卵后受孕后代的模型。

1 Welschen R，Rutte M.Ovulation in adult rats after treatment with pregnant mare serum gonadotrophin during oestrus.Acta Endocrinol（C openh），1971，68（1）：41～49.

2 Hamilton GS，Armstrong DT.The superovulation of synchronous adult rats using follicle-stimulating hormone delivered by continuous infusion.Biol Reprod， 1991，44（5）：851～856.

3 张春燕，刘丽均，狄敏，等.不同剂量孕马血清促性腺激素对未成年大鼠超数排卵效果与质量的影响.中国比较医学杂志，2007，17（6）：338～344.

4 张家骅，主编.家畜生殖内分泌学.北京：中国教育文化出版社，2004.155～166.

5 Ishigame H，Medan MS，Watanabe G，et al.A new alternative method for superovulation using passive immunization against inhibin in adult rats. Biol Reprod， 2004，71（1）：236～243.

6 Goh HH，Yang XF，Tain CF，et al.Oogenesis，fertilization and early embryonic development in rats.I.Dose-dependent effects of pregnant mare serum gonadotrophins.Ann Acad Med Singapore， 1992， 21（4）：443～450.

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8 Miller B，Armstrong D.Effects of a superovulatory dose of pregnant mare serum gonadotropin on ovarian function，serum estradiol，and progesterone levels and early embryo development in immature rats .Biol Reprod，1981，25：261～271.

9 Yun Y，Yu F，Yuen B，et al.Effects of a superovulatory dose of pregnant mare serum gonadotropin on follicular steroid contents and oocyte maturation in rats.Gamete Res，1989，23（3）：289～298.

10 McKieman S，Bavister B.Gonadotrophin stimulation of donor females decreases postimplantation viability of cultured one-cell hamster embryos.Hum Reprod，1998，13（3）：724～729.

Objective To establish a offspring model after using ovulation induction drugs on pregnant rats. Methods mare serum gonadotropin（PMSG）20IU or 40IU and human chorionic gonadotropin（HCG）were injected in female unmated sexual matured SD rats（7～8 weeks old）to superovulated，and then they were mated with male rats. The same dose of saline was given intraperitoneally in control group. Born time、number and weight of offspring were compared to analysis if ovulation model is successful； further experiments including plane righting and pole rotation were performed to detect the refl ection and behavioral skills of newborn offspring. Results All female rats delivered in 20-22 days after mates. The number of offspring was （9±1.5），（11±1.2）and（16±4.2）in control group 20IU PMSG group and 40 IU PMSG group separately. Meanwhile in the three group mean weigh was（8.2±0.3），（7.6±0.25） and （16±4.2）grams separately. There were no differences between the three groups in plane righting and pole rotation. 40IU PMSG group was signifi cantly better than 20IU group（P＜0.05） ，and there was signifi cant difference（P＜0.01）between the control group in the number of offspring rats. So 40IU PMSG was an effective dose in ovulation models and there were no difference in neonatal refl ection and behavioral capabilities in offspring rats. Conclusion Use of PMSG rats that promote after ovulation， after gave birth to their offspring to stimulate ovulation as a human conception model of offspring

PMSG HCG SD rats

江苏省卫生厅项目（H201311）；苏州市科教兴卫项目（KJXW2012006）

215006 苏州大学附属第一医院妇产科