血管紧张素转化酶基因I/D多态性与HiHiLo低氧训练效果的关联性研究

宋志敏，刘海平，2

(1.温州医科大学体育科学学院，浙江温州325035;2.温州医科大学低氧医学研究所，浙江温州325035)

人类血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，又称为肽基二肽酶A(peptidyl dipeptidase A)，是由ACE基因编码的一种含锌的金属糖蛋白，其分子量为150 000 KD。编码ACE蛋白的基因序列第16号内含子上存在一段287 bp片段的插入(insertion，I)/缺失(Deletion，D)多态，该多态位点与血清ACE水平有显著关联性，II、ID及DD基因型受试者ACE浓度分别为(299.3±49)、(392.6±66.8)和(494.1 ±88.3)μg/L［1］。有研究报道，携带I等位基因受试者，其自身血清ACE水平较低，下调的ACE活性可以通过减轻心脏的后负荷压力来增加心输出量和毛细血管的密度，改善运动时骨骼肌血液的供给，维持工作能力［2］。目前关于ACE基因I/D多态性与运动能力的遗传学研究，多集中在该基因多态性与有氧耐力、速度耐力、力量素质的关联性研究方面，其中有氧耐力的可训练性与ACE基因I/D的多态关联性研究成为各国学者关注的焦点。杨贤罡等基于ACE基因I/D多态性与耐力素质的关联性研究的Meta分析研究报道，欧洲人群中II型纯合子与优秀耐力素质明显关联，中国汉族人群未发现显著关联［3］。

关于ACE基因I/D多态位点与低氧训练效果的关联研究较少报道。周付涛等研究报道［4］II型基因型可能参与高原低氧适应的调节。鉴于ACE的生物学功能，其基因多态性也有可能与低氧训练效果的个体差异性有关。本研究选取位于ACE基因序列16号内含子I/D多态，研究该多态位点基因型(genotype)与平原人群进行高住－高练－低训(living high-exercise high-training low，HiHiLo)过程中生理表型指标变化关联性，探究运动员低氧训练过程中生理表型指标改善效果与遗传学基因标记的关联性。

1 研究方法

1.1 研究对象

选35名体质水平相近的健康受试者(男性23名、女性12名)，均系中国北方汉族人群，且所有受试者无低氧暴露经历。受试基本情况见表1。

表1 受试者基本情况(±S)

表1 受试者基本情况(±S)

N年龄/yr 身高/cm 体重/kg 35 19.54±2.55 177.94±4.27 68.07±5.579

1.2 研究方案

本实验采用关联研究方法(Association Study)，研究受试者ACE基因I/D多态性与HiHiLo低氧训练后生理表型指标关联性。所有受试者每天在氧浓度为15.4%的低氧舱内(相当于海拔2 500 m高度)休息和睡眠，低氧暴露时间≥10 h/d(pm 8:00－am 6:00，低氧环境由Hypoxic Tent System TM”和“CAT Hatch TM(美国产)设备制造，由CNJK-AT(中国，天津)监测控制系统检测O2、CO2浓度)，白天在海拔50m的常氧环境下训练、生活。每周在氧浓度为15.4%的低氧环境下进行3次70%O2max强度蹬功率车运动(MONARK 818功率自行车，瑞典)，每次30 min，功率自行车转速为60转/min，HiHiLo低氧实验持续4周。

生理指标测试:HiHiLo低氧实验前后分别测试最大摄氧量(maximal oxygen uptake，O2max)、血象(hematological parameters)等生理表型指标。O2max测试(MedGraphicsVO2000便携式气体代谢分析仪，美国)采用递增负荷运动实验，受试者以60 W为起始运动强度，蹬功率车转速为每分钟60转，每级负荷运动持续3 min，3 min后递增30 W，直至运动力竭;血象指标采用BECKMAN STKS型全自动血细胞分析仪(日本)进行，受试者晨起空腹抽取静脉血0.5 ml，血象测试指标主要包括红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)等。

ACE基因I/D多态性分析:抽取受试者静脉血2ml，2%EDTA抗凝，采用DNA提取专用试剂盒提取受试者DNA(promega公司)。依据人类ACE基因序列16号内含子上一段基因序列设计上、下游引物(Primer 5.0)，上、下游引物分别为:5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’;5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3’(上海生工)。20 μL PCR反应扩增体系(LifePro Thermal Cycler，中国杭州)(2 μL 的 10 × PCR Buffer，1.2 μL 的 25 mM MgCl2，10 mM dNTP 各 1 μL，0.5 μL 的 10 pmol上、下引物，Taq酶2 U，模板100 ng)。扩增方案包括40 s 94℃变性;40 s 54℃退火;40 s 72℃延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳(80 V)40 min，EB荧光染色，紫外透射仪下观察结果并拍照。

1.3 数据处理

所有数据采用SPSS 11.5软件统计包(SPSS software for Windows 11.5 package)统计分析。哈温(Hardy-weinberg)遗传平衡定律检验采用卡方检验(chi square-test，χ2)处理;不同基因型受试者低氧训练前、后生理表型指标统计处理，分别采用单因素方差分析(ANOVA)和协方差分析进行。所有数据以(±S)表示，显著水平设为P＜0.05。

2 结果

2.1 ACE基因I/D多态性的分析结果

35名受试者ACE基因I/D解析结果显示(图1)，II、ID及 DD基因型频率分别为40%、51%，和9%，其中I等位基因频率占66%，D等位基因频率占34%。受试人群基因型的Hardy-weinberg遗传定律通过卡方检验处理，结果显示，χ2值为0.699(P＞0.05)，符合Hardy-weinberg平衡遗传定律，表明该样本具有群体代表性。

图1 ACE基因酶切产物琼脂糖电泳图

2.2 ACE基因I/D多态性与HiHiLo低氧训练后生理表型指标变化的关联性

HiHiLo低氧训练前后，ACE基因I/D多态性不同基因型受试者O2max、Hb、RBC 等生理表型指标变化见表2。结果显示，低氧训练前，ACE基因不同基因型受试者之间O2max、Hb、RBC 指标均无显著性差异。

表2 HiHiLo低氧训练后ACE基因I/D多态性基因型生理表型指标变化(±S)

表2 HiHiLo低氧训练后ACE基因I/D多态性基因型生理表型指标变化(±S)

注:＆:P＜0.10，与ID、II型相比;*:P＜0.05，与ID型相比。图2同。

指标基因型II(14) ID(18) DD(3)基础值rO2max(ml/min·kg)49.21±3.8149.59±4.8752.40±2.43 O2max(ml/min)3484.58±394.03 3275.03±454.37 3587.43±395.27 Hb(g/L) 148.81±17.08 146.19±13.87 145.77±14.69 RBC(×1012/L) 4.70±0.54 4.71±0.46 4.73±0.30变化量ΔrO2max(ml/min·kg)0.85±4.290.31±3.433.30±0.87＆ΔO2max(ml/min)45.45±315.1011.39±221.03228.10±72.13*ΔHb(g/L) －0.52±8.88 －0.24±6.86 2.53±9.92 ΔRBC(×1012/L)0.19±0.43 0.12±0.42 0.33±0.56

4周HiHiLo低氧训练后，ACE基因不同基因型受试者间 ΔO2max存在明显差异(P ＜0.05)，DD 基因型受试者增加了(228.10±72.13)ml/min，提高了6.4%，ID基因型受试者增加了(11.39±221.03)ml/min，仅提高 0.3%;同时，ΔrO2max也表现出 DD基因型受试者改善优于II、ID基因型趋势(P＜0.1，表2，图2)，DD基因型受试者最大摄氧量相对值变化量与低氧训练前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受试者则分别提高1.7%和0.6%。4周HiHi-Lo低氧训练后，Hb和RBC变化量未显现出基因型组间差异(表2)。

图2 ACE基因I/D多态不同基因型间rO2max、O2max变化比较

3 讨论

低氧环境下，低氧浓度信号刺激机体产生一系列生理适应性变化，低氧适应的优劣，对人类在低氧环境下的运动、生活会产生重要的影响。目前，国内外很多运动员进行低氧训练(包括传统高原训练及人工低氧训练等)，以获得低氧训练适应，提高身体机能能力。但因不同个体对低氧环境适应所表现出的生理反应差异性，导致产生了不同的低氧训练适应效果。大量研究表明，不同低氧训练效果差异性与遗传学因素有着密切关联［5－6］。2010年 SCIENCE杂志报道，人类对低氧环境适应与遗传因素有着高度紧密关联［7］。本文选取ACE基因16内含子上I/D多态性，探究其与低氧训练效果个体差异关联性。

本研究结果发现，4周HiHiLo低氧训练后，ACE基因I/D多态与低氧训练后最大摄氧量变化存在着一定的关联性，DD基因型受试者最大摄氧量绝对值的变化量与ID基因型受试者相比有显著性提高，DD基因型受试者提高6.4%，而ID基因型受试者仅提高0.3%，且DD基因型受试者最大摄氧量相对值变化量与低氧训练前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受试者则分别提高1.7%和0.6%，DD基因型有优于II、ID基因型的趋势。但本研究结果未发现ACE基因I/D多态与血象指标关联性。

人类ACE基因是由26个外显子(exon)和25个内含子(intron)组成，位于染色体17q23区域，其转录表达的ACE是膜结合糖蛋白，是一种二肽羧肽酶，ACE在体内的生理作用主要是将十肽血管紧张素-I的C末端亮氨酸和组氨酸残基的肽腱水解，生成八肽的血管紧张素-II，血管紧张素II具有收缩血管和气管平滑肌作用，同时，血管紧张素II在肾素－血管紧张素系统能刺激醛固酮分泌，促进肾小管对钠、钾离子的重吸收，增加血容量，对于心脏具有正性肌力作用和变时作用［8］。有研究报道，ACE基因I/D多态性与血清ACE水平有关，I等位基因携带者可能具有较低氧血清ACE水平［1］，Woods DR报道，较低的血清ACE水平可缓解血管紧张度，降低心脏后负荷，达到增加心输出量效果;此外，促进可促使骨骼肌和心肌吸收葡萄糖和氨基酸，提高能量物质的储存和利用;较低的血清ACE水平，可减少血管紧张素II的生成，调节激素和水盐平衡，从而提高机体在低氧环境下的有氧工作能力［9］。由此推理，携带I等位基因受试者可能具有较好的低氧适应能力。Droma等研究报道［10］，具有较好低氧适应能力的夏尔巴人群I等位基因频率明显高于平原人群;樊辉娟等观察ACE基因I/D多态性在藏、汉人群中分布发现，生活在海拔3 500m左右藏族人群I等位基因频率、II基因型频率明显高于生活在同一地区的汉族人群，且藏族人群血清ACE水平也明显低于汉族人群［11］。平原人群进入高原低氧环境中是否也表现为I等位基因携带者优于D等位基因携带者呢?

从本研究发现，ACE基因I/D多态性中DD基因型受试者经4周HiHiLo训练后，O2max绝对值、相对值改善程度优于II、ID基因型。但这一结果由于DD基因型例数较少，有待于进一步验证。前期关于ACE基因I/D多态性与运动能力关联研究较多，但这些研究结果存在着一些差异。早期Montgomery报道［12］，25名英国优秀运动员ACE基因II基因型频率显著高于对照组;Cieszczyk、Ahmetov等分别观察ACE基因I/D多态性在波兰和俄罗斯优秀运动员分布特点发现，优秀运动员中I等位基因及II基因型频率明显高于对照组［13－14］。但ACE基因I/D多态性在中国北方汉族优秀耐力项目运动员中，并未发现运动员组和对照组之间存在显著性差异［15］。此外，Amir等的研究结果发现［16］，以色列优秀马拉松运动员DD基因型频率和D等位基因频率显著高于短跑运动员与健康普通对照组;2000年Rankinenr报道［17］，高加索人种进行20周耐力训练后，DD纯合子O2max水平显著增加，与II基因型受试者相比，在50W的负荷下，DD基因型受试者的心率下降了36%。2012年，有一项关于ACE基因I/D多态性与HiHiLo低氧训练敏感性的关联研究指出［18］，II、ID基因型受试者有HiHiLo低氧训练敏感性趋势，这与本研究结果趋势性变化存在着不同。通过分析该项研究发现，该研究仅通过比较各组基因型受试者低氧训练自身前后生理表型指标差异显著，且低氧训练后，基因型组间生理表型指标变化量无统计学差异的基础上得出上结论，这可能不够确切。

4 结论

研究结果提示，ACE基因I/D多态性与HiHiLo低氧训练后O2max变化可能存在着一定的关联性。但限于本研究样本数量相对偏少，因此，所得结论有待于今后进一步验证。

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