牛蒡多糖提取工艺及其体外抗氧化活性的研究

周浓，刘亚，解万翠，黄雨平

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

牛蒡多糖提取工艺及其体外抗氧化活性的研究

周浓，刘亚，解万翠，黄雨平

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

采用碱法提取牛蒡多糖，以牛蒡多糖对超氧阴离子、羟基自由基的清除率和多糖提取率为考察指标，探讨料液比、NaOH浓度、提取温度、提取时间对牛蒡多糖提取效果的影响，通过单因素试验和正交试验确定了提取牛蒡多糖的最佳条件为：料液比为1∶30（g/mL），NaOH浓度为0.06 mol/L，提取温度为80℃，提取时间为1 h，牛蒡多糖得率为7.21%。牛蒡多糖对超氧阴离子和羟基自由基均表现出较强的清除能力，其IC50分别为8.27mg/mL和2.54mg/mL。

牛蒡；多糖；提取；抗氧化活性

牛蒡（Arctium lappa L.）又称蒡翁菜、大力子、牛鞭菜，是菊科牛蒡属二年生的草本植物，为药食两用的食品，营养丰富，而且具有独特香气。牛蒡适合在温带生长，我国大部分地区都适合种植，主要产地在江苏、甘肃。牛蒡在中国的产量比较大，产品主要出口到日本和韩国等地区，经济效益比较高。近年来，牛蒡的营养、保健和药用价值引起了人们的关注，因此加强了对牛蒡的营养、食用和药理等方面的研究。研究发现，牛蒡中含有的各种活性成分，可以对自由基起一定清除作用，还含有丰富的多糖、纤维素、钙、铁、钾、镁、磷、VC、胡萝卜素、多酚、氨基酸等营养成分，且具有抗疲劳、抗氧化、抗菌、抗突变、降低尿酸和血脂等作用［1-6］。

根据分析［7-8］，自由基会损害人体的免疫系统，导致一系列致病，如：心血管病、衰老和癌症的产生。想延缓机体衰老、预防疾病，应采取措施降低内源性自由基的产生。许多植物多糖具有较强的抗氧化活性［9］，牛蒡多糖属于其中的一种，所以牛蒡多糖的研究有着广阔的应用前景。植物多糖的提取方法主要有：水提法、酸提法、碱提法、超声波强化法、微波辅助提取法、酶解法等，本试验选择碱法提取牛蒡多糖。碱提法具有提取率高、节省时间、减少原材料消耗等优点［10］。在研究植物多糖的提取工艺中，几乎都是利用多糖的提取率来考察多糖的最优提取工艺。多糖在提取过程中可能会破坏其抗氧化功效，因此本试验以对超氧阴离子、羟基自由基的清除率和牛蒡多糖得率为指标来探究碱法提取牛蒡多糖最佳提取工艺，并对提取的牛蒡多糖进行体外抗氧化活性测定，评价其抗氧化功效，为牛蒡进一步开发利用和医药工业生产牛蒡多糖提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

牛蒡干片：购于湛江市昌大昌超市。

主要试剂：葡萄糖、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、甲基红、氢氧化钠、盐酸、硼酸、苯酚、石油醚、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢（30%）均为国产分析纯。

仪器：电热恒温鼓风干燥器（9070MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；组织捣碎机（HR172）：飞利浦家庭电器有限公司；可见分光光度计（WFJ2100）：尤尼柯（上海）仪器有限公司；离心机（80-2）：上海浦东物理光学仪器厂；电热恒温水浴锅（HHS型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；托盘电子分析天平（AY120）：日本岛津公司；电子天平（BL-220H）：日本岛津公司；紫外可见分光光度计（TU-1800S）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2方法

1.2.1牛蒡多糖的提取工艺流程

牛蒡干片→粉碎→碱液提取→离心→除蛋白→离心→醇沉→离心→沉淀复溶于水→粗多糖提取液

1.2.2牛蒡多糖样品制备

精确称取牛蒡粉1.00 g，加入250 mL锥形瓶中，按照设定的因素水平水浴恒温提取，提取结束后于4 000 r/min离心10 min，取上清液浓缩后加入2倍体积15%三氯乙酸除蛋白，混匀后静止10 min，于4 000 r/min离心10 min，取上清液加入3倍体积95%乙醇溶液醇沉，混匀后静止过夜，于4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用蒸馏水溶解备用。

1.2.3葡萄糖标准曲线的绘制

分别准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）置于10 mL比色管中，加蒸馏水补至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，然后快速加入5.0 mL浓硫酸，冷却10 min，30℃水浴20 min，室温冷却，在490 nm波长处测定葡萄糖标准溶液的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，得回归方程为A=0.007 8x+ 0.146 5，R2=0.993 4。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1The standard curve of dextrose density

1.2.4牛蒡多糖得率测定

采用苯酚硫酸法测定牛蒡多糖含量，准确吸取1mL样品溶液于10mL比色管中，按照标准曲线操作步骤，在相同的条件下测定吸光度。再按公式计算多糖得率。

式中：m1为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，μg；m2为样品质量，g；V1为样品定容体积，mL；V2为比色测定时所移取样品测定液的体积，mL；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.2.5牛蒡多糖对超氧阴离子清除率的测定

根据文献［11］，在比色管中加入pH8.2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液4.5 mL，25℃水浴预热20 min，然后分别加入1 mL样品溶液和25 mol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，混合后于25℃水浴5 min，再加入8 mol/L HCl 1 mL，在299 nm处测定吸光度（A0），空白组以相同体积的蒸馏水代替样液，按公式计算清除率。

式中：Ai为加入样品后的吸光度值；A0为未加样品时的吸光度值。

1.2.6牛蒡多糖对羟基自由基清除率的测定

根据文献［12］，在10 mL比色管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L的水杨酸溶液2.0 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL和样品溶液2 mL，水浴1 h，水浴温度保持37℃，在波长510 nm处测其吸光度值A0，在上述体系中分别加入不同量的样品溶液测定吸光度值Ai，按公式计算清除率。

式中：Ai为加入样品后的吸光度值；A0为未加样品时的吸光度值。

2结果与分析

2.1牛蒡多糖提取单因素试验

2.1.1料液比对牛蒡多糖提取效果的影响

精确称取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取其中多糖。料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），70℃下提取1 h，料液比对牛蒡多糖提取效果的影响结果见图2。

图2　不同液料比对多糖得率及多糖清除自由基效果的影响Fig.2Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different liquid ratio

由图2可以看出，牛蒡多糖对羟基自由基的清除效果比超氧阴离子能力强。随着料液比的增大，多糖得率明显上升，直到料液比为1∶25（g/mL）时，才出现平缓的下降；多糖对超氧阴离子和羟基自由基的清除率也是平缓增加直到料液比为1∶25（g/mL）时才平缓下降，因此选定料液比为1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）做正交试验。

2.1.2碱液浓度对牛蒡多糖提取效果的影响

精确称取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，提取牛蒡的多糖。分别加入浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mol/L的NaOH溶液，料液比是1∶20（g/mL），70℃下提取1 h，碱液浓度对牛蒡多糖提取效果的影响结果见图3。

图3　不同碱液浓度对多糖得率及多糖清除自由基效果的影响Fig.3Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different alkali solution concentrations

由图3可以得知，牛蒡多糖对羟基自由基的清除率高于超氧阴离子。随着碱液浓度的增大，多糖的得率和对超氧阴离子及羟基自由基的清除率都开始出现明显上升，当NaOH浓度增大到0.06 mol/L后，多糖的得率和对超氧阴离子与羟基自由基的清除率开始出现逐步下降。所以选定碱液浓度为0.06、0.09、0.12 mol/L做正交试验。

2.1.3时间对牛蒡多糖提取效果的影响

准确称取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取其中多糖。提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比是1∶20（g/mL），提取温度为70℃，提取时间对牛蒡多糖提取的影响结果见图4。

图4　不同提取时间对多糖得率及多糖清除自由基效果的影响Fig.4Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracted under different extracted times

由图4可以得出，随着提取时间的增加，多糖的得率和对羟基自由基及超氧阴离子清除率都呈现平缓上升。当时间大于1.5 h后，多糖的得率出现明显的下降，而多糖对羟基自由基和超氧阴离子清除率则平缓下降。当时间大于2 h时，多糖对羟基自由基及超氧阴离子清除率才出现明显的下降，因此选择提取时间为1、1.5、2 h进行正交试验。

2.1.4温度对牛蒡多糖提取效果的影响

准确称取牛蒡粉1.00 g，于250 mL三角瓶中，加入0.1 mol/L的NaOH溶液提取牛蒡的多糖。提取温度分别为50、60、70、80、90℃，以料液比是1∶20（g/mL），提取时间为1 h，提取温度对多糖提取的影响结果见图5。

图5　不同提取温度对多糖得率及多糖清除自由基效果的影响Fig.5Effect of polysaccharide content and free radicals removing of polysaccharide extracte under different temperatures

从图5可以看出，随着提取温度的提高，多糖的得率和对羟基自由基的清除率均呈现出先增加后减少的趋势，而对超氧阴离子的清除率却变化不大。所以选定提取温度为70、80、90℃进行正交试验。

2.3牛蒡多糖提取工艺条件的优化

根据单因素试验的结果，选择L9（34）正交试验，确定牛蒡多糖提取工艺条件，因素水平见表1，结果见表2。

表1　正交试验因素水平表Table 1Factor level of the orthogonal test

表2　正交试验结果Table 2The results of orthogonal test

由表2可知，影响牛蒡多糖对超氧阴离子清除率的主要因素次序为B＞C＞A＞D，即碱液浓度＞提取时间＞料液比＞提取温度，得到最佳组合是A2B1C1D2。影响牛蒡多糖对羟基自由基清除率主要因素次序为B=C＞A＞D，即碱液浓度=提取时间＞料液比＞提取温度，最佳组合是A3B1C1D1。影响多糖得率主要因素次序为D＞B＞C＞A，即提取温度＞碱液浓度＞提取时间＞料液比，最佳组合是A3B1C2D2。

正交试验结果表明，牛蒡多糖对两种离子的清除率和多糖得率的最优提取工艺不完全相同，研究的各因素对牛蒡多糖的羟基自由基清除率影响比超氧阴离子清除率大，故选取A3效果最好，同理分析因素D可得，选取D2效果最好。分析因素C选择牛蒡多糖对两种离子的清除能力效果最好的C1，即最佳提取工艺为A3B1C1D2。

由于最佳组合不在试验设计中，需做验证试验，以最佳组合的提取条件重复验证3次，结果取平均值，得到牛蒡多糖得率为7.21%，牛蒡多糖对超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别为12.13%、37.65%。

3牛蒡多糖对超氧阴离子、羟基自由基的清除能力

3.1牛蒡多糖对超氧阴离子的清除能力

不同浓度牛蒡多糖对超氧阴离子的清除能力结果如图6。

图6　不同浓度的牛蒡多糖对超氧阴离子清除率的影响Fig.6The effect of different concentrations of burdock polysaccharides on the clearance rate of superoxide anion

从图6中可以看出，在浓度0～2 mg/mL内，牛蒡多糖对超氧阴离子的清除能力随着浓度的上升而逐渐增强，说明牛蒡多糖对超氧阴离子的清除能力与浓度呈一定的量效关系。经计算牛蒡多糖对超氧阴离子IC50为8.27 mg/mL。

3.2牛蒡多糖对羟基自由基的清除能力

不同浓度牛蒡多糖对羟基自由基的清除能力结果如图7。

图7　不同浓度的牛蒡多糖对羟基自由基清除率的影响Fig.7The effect of different concentrations of burdock polysaccharides on the clearance rate of hydroxyl radical

从图7中可以看出，在浓度0～2 mg/mL内，牛蒡多糖对羟基自由基的清除能力随浓度的增加而增强，说明牛蒡多糖对羟基自由基清除能力与浓度呈较明显的量效关系。经计算牛蒡多糖对羟基自由基IC50为2.54 mg/mL。

4结论

采用牛蒡为原料，提取牛蒡多糖，以牛蒡多糖对超氧阴离子、羟基自由基的清除率和牛蒡多糖得率为考察指标，通过对影响牛蒡多糖提取的多种因素进行优选，确定了最佳工艺参数是：料液比1∶30（g/mL），NaOH浓度为0.06 mol/L，提取时间为1 h，提取温度为80℃。在此工艺条件下，牛蒡多糖得率为7.21%，牛蒡多糖对超氧阴离子的清除率为12.13%，对羟基自由基的清除率是37.65%。体外抗氧化试验表明，牛蒡的多糖对羟基和超氧阴离子的自由基均表现出较强的清除能力，对羟基自由基的清除效果比超氧阴离子好，清除自由基的能力与浓度呈较明显的量效关系。

［1］魏东.牛蒡提取物抗疲劳作用的研究［J］.安徽农业科学，2006，34（13）:3171-3172

［2］鲁政，张静，高兆兰，等.牛蒡菊糖和菊芋菊糖对酒精诱导大鼠慢性氧化损伤的防治作用［J］.食品科学，2010，31（5）:270-273

［3］魏东.牛蒡抗氧化、降血脂保健功能研究［J］.食品科学，2008，29（2）:380-382

［4］于垚，康廷国，王冰，等.牛蒡根粉减肥、降血脂功效实验研究［J］.山西中医学院学报，2008，9（2）:24-25

［5］Allemand A，Mendes D A G B，André E，et al.Ethanolic extract of roots from（Arctium lappa L.）accelerates the healing of acetic acidinduced gastric ulcer in rats:Involvement of the antioxidant system Original Research Article［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，51:179-187

［6］Ferracane R，Graziani G，Gallo M，et al.Metabolic profile of the bioactive compounds of burdock（Arctium lappa）seeds，roots and leaves［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，51:399-404

［7］钟秀倩.氧自由基与疾病［J］.韶关学院学报（自然科学版），2006，27（6）:87-90

［8］陈毅鸿.自由基、微量元素与人体健康［J］.山西食品工业，2005（1）:40-42

［9］俞慧红，竺巧玲，戴飞，等.多糖抗氧化作用的研究现状［J］.食品研究与开发，2008，29（3）:172-176

［10］丁重阳，张笑然，张梁，等.姬松茸胞内多糖碱提取工艺的研究［J］.生物加工过程，2008，6（5）:21-26

［11］范晓，严小军，房国明，等.高分子量褐藻多酚抗氧化性质研究［J］.水生生物学报，1999，23（5）:494-499

［12］郭青枝，赵二劳，白建华.沙棘叶提取物抗氧化性能研究［J］.研究化学与生物工程，2008，25（3）:58-59

Extraction of Burdock Polysaccharide and Its Antioxidant Activity

ZHOU Nong，LIU Ya，XIE Wan-cui，HUANG Yu-ping
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

The extraction of polysaccharides from burdock by alkalinity methods was studied.The target was yield of polysacchrides，the clearance rates of superoxide anion and hydroxyl free radical and the yield by burdock polysaccharide were examining indexes.The liquid ratio，NaOH concentration，extraction temperature，and extraction time were discussed to determine the extracting effects of burdock polysaccharide. According to the single factor experiment and orthogonal experiment，the optimized condition of extraction of burdock polysaccharides was as follows.Ratio of solid to liquid 1∶30（g/mL），NaOH concentration 0.06 mol/L，extraction temperature 80℃，time 1 h，the yield of polysaccharides was 7.21%.The antioxidant experiments showed that burdock polysaccharides had good scavenging effect to superoxide radical and hydroxide free radical，and the contents of IC50were 8.27 mg/mL and 2.54 mg/mL respectively.

burdock；polysaccharide；extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.011

2014-08-21

湛江市科技专项竞争性分配项目（2013A03014）

周浓（1967—），女（汉），高级实验师，本科，研究方向：食品质量与安全，农产品加工。