二氢辣椒碱标准样品的研制

陈静娴，王岱杰，周晓晶，牟玉柱，李强，耿岩玲，于金倩，王晓

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省分析测试中心，山东济南250014；3.北京理化分析测试中心，北京100089；4.烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东烟台264000）

二氢辣椒碱标准样品的研制

陈静娴1，2，王岱杰2，*，周晓晶3，牟玉柱4，李强2，耿岩玲2，于金倩2，王晓2，*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省分析测试中心，山东济南250014；3.北京理化分析测试中心，北京100089；4.烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东烟台264000）

建立了二氢辣椒碱标准样品的研制方法。采用催化氢化还原辣椒碱提取物和重结晶的方法制备二氢辣椒碱，UV、IR、MS和NMR等方法对二氢辣椒碱结构鉴定，并进行了均匀性、稳定性检验，经国内8个具有分析资质的实验室进行协同定值，二氢辣椒碱标准样品的标准值为99.30%，置信度95%的不确定度值为0.32%。所制得二氢辣椒碱标准样品达到国家标准样品的技术要求，可用于有关二氢辣椒碱检测方法的校正和相关产品的质量控制。

二氢辣椒碱；标准样品；均匀性；稳定性；定值；不确定度

辣椒是我国药典收录药材，为茄科植物辣椒Capsicum annuum L.或其栽培变种的干燥成熟果实，温中散寒，开胃消食，用于寒滞腹痛，呕吐，泻痢，冻疮等病症［1］。辣椒也是全世界消费量最大的调味品和蔬菜之一，随着辣椒的精深加工，其产品逐步成为重要的天然色素、制药原料和其它工业原料。辣椒中辛辣味物质主要是辣椒碱类化合物，为一类含酚羟基生物碱，主要包括辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱等化合物。研究表明辣椒碱类化合物具有长效镇痛，抗菌消炎的作用［2-3］，对牛皮癣、秃发、带状疱疹后神经痛、牛皮癣、皮肤搔痒症，糖尿病性神经痛等症状具有明显的治疗效果［4-8］。二氢辣椒碱（结构式见图1）是药典中规定辣椒的检测指标，截至目前，我国尚无二氢辣椒碱标准样品，市售二氢辣椒碱对照品纯度也参差不齐。因此，为了满足药材及成药分析检测及质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备二氢辣椒碱标准样品。

图1　二氢辣椒碱的化学结构式Fig.1The chemical structure of dihydrocapsaicin

1材料与方法

1.1材料

HPLC用甲醇为色谱纯：山东禹王实业有限公司化工分公司；10%Pd/C：阿拉丁试剂有限公司；乙醇、乙醚、正戊烷、盐酸等均为分析纯：天津市广成化学试剂有限公司；水为去离子水；天然辣椒总碱提取物：吉安市国光香料厂，辣椒碱含量66%，二氢辣椒碱含量30%。

1.2仪器

R-3旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 6520 Q-ToF液质联用仪：美国Agilent公司；WRS-1B数字熔点仪：上海精密科学仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；INOVA 600 MHz核磁共振波谱仪：美国Varian公司；Vario EL III全自动元素分析仪：德国ELEMENTAR公司。

1.3方法

1.3.1催化合成二氢辣椒碱

将天然辣椒总碱提取物（1.0 g）溶于150 mL乙醇，氮气保护下加入10%Pd/C（250 mg），在室温下通入氢气还原4 h。反应结束后过滤除去催化剂，滤液经减压蒸馏至干，粗产物用正戊烷重结晶得二氢辣椒碱，收率89%。

1.3.2纯度分析方法

采用等度HPLC、梯度HPLC、薄层色谱、HPLCMS等多种方法对所制备的二氢辣椒碱样品进行纯度检验，条件如下：

等度HPLC分析条件：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：甲醇/水=72/28；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；运行时间：30 min；检测波长：280 nm。

梯度HPLC分析条件：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：A为甲醇，B为水；梯度调：0～20 min，72%A，20 min～40 min，72%A～100%A，40 min～50 min， 100%A；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；运行时间：50 min；检测波长：280 nm。

薄层色谱条件：正己烷/乙酸乙酯（2/1）和正己烷/乙酸乙酯/甲醇（4/1/0.5），荧光检测。

MS条件如下：ESI电喷雾离子源，毛细管电压4.0 kV，载气：普氮，载气流速：10L/min，载气温度：300℃，扫描范围为m/z=100～1 000。

1.3.3结构鉴定

采用UV、IR、MS和NMR等方法对二氢辣椒碱进行结构鉴定。

1.3.4均匀性检验

按照GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35：2006《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法（7均匀性研究）》要求，采用的是随机顺序重复测量的方法，从分装后的样品中随机抽取10瓶样品（＞，按3种程序（第一次：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第二次：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第三次：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9）分别从每瓶中称取0.2 mg样品3份，每份样品分别用1.0 mL色谱甲醇溶解，按1.3.2等度HPLC分析，以面积百分比读取样品的纯度值。检测数据用方差分析法进行分析，以判断标准样品的均匀性是否合格。

1.3.5稳定性检验

二氢辣椒碱样品于2℃～8℃保存，以两年为期，采用对制备的二氢辣椒碱样品每6个月取样检验，按1.3.2等度HPLC分析，以面积百分比读取样品的纯度值，每份试样以测定5次的平均值为其定值结果，用t检验对数据进行统计分析［9］。

1.3.6定值

按照标准样品工作导则，采用多个实验室协作试验定值，参加实验室的数目为8个［9-12］。随机抽取24瓶样品，每个定值实验室送3瓶，每瓶平行测定2次。定值实验室将样品配成一定浓度的溶液，高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。

2结果与讨论

2.1合成路线的设计

二氢辣椒碱分离主要采用硅胶柱色谱、制备液相色谱、高速逆流色谱等方法［13-15］，分离过程中存在制备量小、步骤繁琐、溶剂消耗量大等缺点。二氢辣椒碱的传统合成方法一般是由香草醛为起始原料，首先经过多步反应制得辣椒碱，辣椒碱在催化剂下进行催化还原，最终制得二氢辣椒碱［16］。该法路线较长，反应条件苛刻，后处理繁琐，收率较低。对辣椒提取物进行高效液相色谱分析时发现，天然辣椒总碱提取物主要成分为辣椒碱和二氢辣椒碱，其中辣椒碱占66%，二氢辣椒碱占30%。二氢辣椒碱与辣椒碱在化学结构上的区别仅为双键部分，因此，我们设计将辣椒提取物进行催化氢化还原，其中的辣椒碱被还原后总成分即变成二氢辣椒碱。如图2所示。

图2　二氢辣椒碱制备工艺路线Fig.2The preparation process of dihydrocapsaicin

2.2结构鉴定

表1　二氢辣椒碱的核磁共振氢谱数据（氘代溶剂CDCl3）Table 1The1H-NMR data of dihydrocapsaicin（CDCl3）

2.2均匀性检验

均匀性是标准样品最基本的属性，它是用来描述标准样品空间分布特征的。其定义是：以相同的结构或成分存在，并具有一种或多种性能的物料的一种状态。对具有一定规格的样品，不论此标准样品是否取自同一包装（如瓶、包），通过检验，其被测定特性值都落在规定不确定度范围内，就该标准样品的这一特性而言称为均匀。

表2　二氢辣椒碱的核磁共振碳谱数据（氘代溶剂CDCl3）Table 2The13C-NMR data of dihydrocapsaicin（CDCl3）

以F检验，确定二氢辣椒碱标准样品的均匀性数据是否附合正态分布。其结果如下表3、表4、表5。

表3　均匀性检验测量数据Table 3Data of homogeneity test %

重复性标准偏差可由MSwithin计算：

表4　每瓶的平均值、方差和测量次数Table 4The mean，variance and time of measurement in each bottle

表5　均匀性研究的方差分析表Table 5The analysis of variance in homogeneity test

均匀性检验的不确定度Ubb=sbb=0.005

从上表可见，以υ1（即组间）=9及υ2（即组内）=20，查F界值表，得F0.05（9，20）=2.94，由于F=MS间/MS内= 1.19＜F0.05（9，20），所以本样品是均匀的。

2.3稳定性检验

标准样品在规定的条件下储存，在规定的时间间隔内，其描述的性能数值应保持在规定的限量范围内。标准样品的稳定性是用来描述标准样品的特性值随时间变化的。

表6　稳定性检验测量数据Table 6Data of stability test

从上表数据看，每次测得的平均值在测定时间内没有随时间的变化而明显的升高或降低，按计算，测定值应在且均在99.41%±0.13%内，该样品在两年内是稳定的。

用t检验对数据进行统计分析，二氢辣椒碱标准样品随时间变化而均匀发生变化，采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化对标准样品的稳定性变化进行预测，为此做了如下数理处理：

斜率可以用下式计算：

截距由下式计算：

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

取其平方根s=0.051，与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为n-2和p=0.95（95%置信水平）的分布t因子等于3.182

由于：

即：|b1|＜0.008 6

所以，斜率的变化不显著。因而二氢辣椒碱标准样品在两年内未观测到明显的不稳定性。

有效期t=24个月的长期稳定性的不确定度的贡献为：

扩展不确定度U扩=2U=0.065×2=0.13

2.4定值

定值是指采用技术上有效的方法，确定样品的一个或多个特征值的程序。此程序导致产生标准样品证书或相应文件。标准样品定值一般情况下采用技术有效、严谨认可的方法来完成。实验结果如表7。

对所采集的测定结果，采用格拉布斯（Grubbs）检验法进行检验，未发现异常值，测定结果呈正态分布。根据GB/T 15000.3-2008/ISO Guid 35：2006《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则为和统计方法》标准规定，定值结果由标准值和不确定度组成。依据高效液相色谱法峰面积归一法所得全部测定结果，计算出二氢辣椒碱标准样品的标准值。标准样品特性标准值的测量不确定度UCRM由标准值定值试验的不确定度U（x=）、均匀性检验的不确定度Ubb和稳定性检验的不确定度Ults组成，检测结果和数据统计学处理详见定值报告。二氢辣椒碱标准样品的HPLC纯度定值结果为标准值：99.30%，置信度为95%的不确定度值：0.32%，实验室内标准偏差Sr：0.05%，实验室间标准偏差SL：0.09%。

表7　二氢辣椒碱纯度定值结果统计分析表Table 7The statistic analysis of dihydrocapsaicin purity value results

3结论

本研究针对我国缺少二氢辣椒碱国家实物标准样品的现状，对二氢辣椒碱标准样品进行研制，建立了二氢辣椒碱标准样品的制备方法。根据GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》，对制得二氢辣椒碱样品进行了均匀性、稳定性及定值研究。制备出标准值为99.30%，扩展不确定度（95%置信区间）为0.32%的二氢辣椒碱标准样品，该标准样品符合国家一级标准样品的技术规范要求，填补了国内该领域的研究空白。该标准样品的研制可满足辣椒及相关产品分析检测、质量控制工作的需求，为其检测结果的准确性、可比性和溯源性提供技术支撑和量值溯源保证。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典:2010年版一部［M］.北京:化学工业出版社，2010，347-348

［2］Rainer Gamse.Capsaicin and nociception in the rat and mouse［J］. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology，1982，320（3）: 205-216

［3］F Y Lam，W R Ferrell.Capsaicin suppresses substance P-induced joint inflammation in the rat［J］.Neuroscience Letters，1989，105（1/2）: 155-158

［4］Lawrence G Sharpe，Jerome H Jaffe.Captopril and capsaicin modify opioid withdrawal in the morphine-dependent rat［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior，1989，33（4）:899-902

［5］A Peikert，M Hentrich，G Ochs.Topical 0.025%capsaicin in chronic post-herpetic neuralgia:efficacy，predictors of response and long-term course［J］.Journal of Neurology，1991，238（8）:452-456

［6］Joel E Bernstein，Lawrence C Parish，Marvin Rapaport，et al. Rosenbaum，Henry H.Roenigk Jr.Effects of topically applied capsaicin on moderate and severe psoriasis vulgaris［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，1986，15（3）:504-507

［7］Debra L Breneman，J Scott Cardone，Renee F Blumsack，et al. Topical capsaicin for treatment of hemodialysis-related pruritus［J］. Journal of the American Academy of Dermatology，1992，26（1）:91-94

［8］K Theesen，W Marsh.Relief of diabetic neuropathy with fluoxetine［J］.The Annals of Pharmacotherapy，1989，23（7/8）:572-574

［9］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35:2006标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法［S］.北京:中国标准出版社，2008

［10］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T15000.1-1994标准样品工作导则（1）在技术标准中陈述标准样品的一般规定（等效采用ISO Guide 6《在国际陈述标准样品的一般规定》）［S］.北京:中国标准出版社，1994

［11］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T15000.2-1994标准样品工作导则（2）标准样品常用术语和定义（等效采用ISO Guide 30《标准样品常用术语和定义》）［S］.北京:中国标准出版社，1994

［12］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 8170-2008数值修约规则与极限数值的表示和判定［S］.北京:中国标准出版社，2008

［13］赵爱云，石磊，李钐.辣椒碱的分离纯化及分析［J］.青岛大学学报（工程技术版），2004，19（4）:24-26

［14］艾秀珍，沈波，危凤，等.反相制备液相色谱分离纯化辣椒碱单体［J］.高校化学工程学报，2008，22（5）:774-778

［15］Fuwei Li，Yunliang Lin，Xiao Wang，et al.Preparative isolation and purification of capsaicinoids from Capsicum frutescens using highspeed counter-current chromatography［J］.Separation and Purification Technology，2009，64（3）:304-308

［16］Peter M Gannett，Donald L Nagel，Pam J Reilly，et al.The Capsaicinoids:TheirSeparation，Synthesis，and Mutagenicity［J］.J Org Chem，1988，53:1064-1071

Preparation of Certified Reference Materials of Dihydrocapsaicin

CHEN Jing-xian1，2，WANG Dai-jie2，*，ZHOU Xiao-jing3，MOU Yu-zhu4，LI Qiang2，GENG Yan-ling2，YU Jin-qian2，WANG Xiao2，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal Univesity，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Academy of Sciences，Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，Shandong，China；3.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；4.Yantai Changyu Pioneer Wine Co.，Ltd.，Yantai 264000，Shandong，China）

To establish the preparation technique of the certified reference material of dihydrocapsaicin. Dihydrocapsaicin was prepared by Pd/C catalytic hydrogenation of capsaicin extract and recrystallization.Its chemical structure was identified by UV，IR，MS and NMR.The homogeneity and stability were systematic checked.A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories.The results showed that the certified value of the reference material of dihydrocapsaicin was 99.30%with the expanded uncertainty of 0.32%in confidence coefficient of 95%.The reference material of dihydrocapsaicin can conform to the technical requirement of the certified reference material.The materials were intended for use in the method validation and quality control of regarding products.

dihydrocapsaicin；certified reference material；homogeneity；stability；certification；uncertainty

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.020

2014-04-21

2013国家质检公益性行业科研专项（201310243）；山东省海外高层次人才资助专项资金；北京市科学技术研究院市级财政项目（PXM2013_178305_000009）

陈静娴（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物化学。