槐米中芦丁的提取及抗氧化活性研究

洪军，胡晓稳，王佩，李丹丹

（河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036）

槐米中芦丁的提取及抗氧化活性研究

洪军，胡晓稳，王佩，李丹丹

（河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036）

为了进一步开发利用来自槐米中的芦丁，采用碱提酸沉法获得芦丁粗提物，并通过普鲁士蓝法、水杨酸法、邻苯三酚法和ABTS法分别探讨了槐米中芦丁提取物对Fe3+的还原能力，以及对·OH、O2-·和ABTS自由基的清除能力。结果表明：与VC相比，槐米中芦丁提取物在质量浓度为0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时的还原能力和对·OH自由基的清除能力较强；对O2-·和ABTS自由基的清除能力较弱。

槐米；芦丁粗提物；抗氧化活性

芦丁（Rutin），又称芸香甙，属于黄酮类化合物。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一类化合物，尤其在高等植物中含量较多。近年来，黄酮类化合物已成为国内外医药、食品及化妆品等领域的研究热点，它不仅是天然活性成分中极具应用潜力的资源之一，而且是低毒甚至无毒的药用成分，具有抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、免疫调节作用、抗氧化、延缓衰老等作用［1-3］。芦丁也已被广泛应用于医药、保健食品和化妆品中，具有很高的开发和利用价值。我国芦丁的生产主要从槐米中提取，含量最高可达30%左右。槐米为豆科植物槐的干燥花蕾及花，中国各地均有分布，其中以黄土高原和华北平原居多。作为药食两用植物，价格低廉、无毒无害、分布及应用相当广泛。

本试验采用碱提酸沉法从槐米中提取芦丁粗提物，随后对其粗提物进行还原能力、·OH、O2-和ABTS自由基的抗氧化活性进行测定，一方面为开发槐米芦丁的抗氧化性能的研究提供科学依据，另一方面为进一步促进我国槐米资源的综合利用，创造出更高的经济和社会效益。

1材料与方法

1.1材料与仪器

槐米自购于平顶山九头崖超市；芦丁标准品，购于上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠、水杨酸、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、VC等均为分析纯；T6新世纪型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2方法

1.2.1原料处理

槐米，放入烘箱60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用。

1.2.2芦丁的提取

采用碱提酸沉法，取槐米适量于圆底烧瓶中，加入一定量饱和氢氧化钙和少量硼砂，pH调至8～9，煮沸后过滤，滤渣重复操作，合并滤液，盐酸调pH 4～5，静置沉淀吸除上清液，沉淀物反复水洗，干燥得粗提物［4］。

1.2.3标准曲线制备及粗提物芦丁含量测定

准确吸取芦丁标准品溶液，在510 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。根据标准曲线测定出样品的吸光度，由回归方程计算出样品溶液中芦丁的质量，并计算芦丁提取率。

1.2.4粗提物芦丁的抗氧化活性测定

1.2.4.1用普鲁士蓝法测定粗提物还原能力

参照文献［5］方法并做改进，配制VC、芦丁标准品及粗提物芦丁浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的样液，反应体系为：移取1 mLVC、芦丁标准品及芦丁粗提物溶液于不同的比色管中，依次加入1 mL0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6），1 mL质量分数为1%的K3Fe（CN）6溶液，50℃下水浴20 min，再加入1 mL质量分数为10%的三氯乙酸溶液，3000r/min下离心10min后取2 mL上清液，加入3 mL去离子水，0.2 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀以后用去离子水作对照组，700 nm下测其吸光度。吸光度值越大表明还原力越强。然后以样品浓度为横坐标，吸光值大小为纵坐标，在同坐标中表示出VC与芦丁样品的抗氧化活性。

1.2.4.2对·OH自由基清除率的测定

参照文献［6］方法并做改进，配制VC、芦丁标准品及粗提物芦丁浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的样液。将7.5 mmol/L FeSO4溶液、7.5 mmol/L水杨酸乙醇溶液和7.5 mmol/L H2O2溶液按1∶1∶1的比例混合，作为检测储备液备用。分别移取上述样液1 mL于5 mL容量瓶中，加入2 mL检测储备液，用去离子水定容至5 mL。用去离子水做空白对照调零点，在526 nm处测定样品吸光值为A1。以去离子水代替上述样品溶液，其他步骤同上，得A0，根据以下公式计算清除率。

式中：I为样品对OH·的清除率；A0为不含样品的检测液的吸光度值；A1为含样品的检测液的吸光度值。

1.2.4.3对除O2-·的清除率的测定

参照文献［6］方法并做改进，配制VC、芦丁标准品及粗提物芦丁浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的样液。取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL和不同浓度的样液1 mL于试管中，25℃水浴预热20 min，之后加入0.2 mmol/L的邻苯三酚溶液0.5 mL，混匀后25℃水浴中反应5 min，最后加入1.0 mL 8 mol/L HCl终止反应。以Tris-HCl溶液为调零点，在320 nm处测定样品吸光度为A1，同体积的蒸馏水代替样品提取液，测定吸光度为A0。计算参考1.2.4.2中对OH·清除率的公式。

1.2.4.4对ABTS+清除率的测定

参照文献［6］方法并做改进，将7 mmol/L的ABTS与1.4 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合，室温12℃～16℃避光放置16 h，成ABTS+储备液。临用前用无水乙醇稀释至吸光度为0.7+0.02，得ABTS+工作液。取2.8mL ABTS+工作液与0.2 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的样品室温反应6 min后迅速于734 nm处测定A1。以去离子水代替上述样品溶液，其他步骤同上，得A0。计算参考1.2.4.2中对OH·清除率的公式。

2结果与分析

2.1标准曲线及粗提物芦丁含量测定

制作的标准曲线表明线性范围宽，重现性好，回归方程为：y=0.533 8x+0.003 9，相关系数R2=0.999 8。根据标准曲线回归方程，粗提物芦丁得率为19.3%。

2.2粗提物芦丁的抗氧化活性测定

2.2.1芦丁粗提物的还原能力及对羟基（·OH）自由基清除能力测定

芦丁粗提物的还原能力及对羟基（·OH）自由基清除能力测定见图1、图2。

图1　芦丁粗提物的还原能力Fig.1Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on reducing power

图2　芦丁粗提物对·OH的清除能力Fig.2Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on hydroxyl radical

由图1和图2可知，随着质量浓度的升高，VC、芦丁标准品及槐米中芦丁提取物的还原能力及对·OH自由基清除能力逐渐增强。与VC相比，芦丁标准品及槐米中芦丁提取物的还原能力及对·OH自由基清除能力较强。在质量浓度为20 μg/mL～100 μg/mL时，芦丁标准品的还原能力最强；但在质量浓度为0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时芦丁粗提取物对·OH自由基清除能力与芦丁标准品相当，清除率最高可达40%以上。

2.2.2芦丁粗提物对超氧阴离子（O2-·）和ABTS+自由基清除能力测定

芦丁粗提物对超氧阴离子（O2-·）和ABTS+自由基清除能力测定见图3、图4。

图3　芦丁粗提物对O2-·清除效果Fig.3Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on superoxide anion radical

图4　芦丁粗提物对ABTS自由基的清除效果Fig.4Scavenging ability of crude extract rutin from sophora japonica on ABTS radical

由图3和图4可知，随着浓度的升高（0.2 mg/mL～1.0 mg/mL），VC、芦丁标准品及槐米中芦丁提取物对O2-·和ABTS+的清除能力均在逐渐增强；但与VC相比，芦丁标准品及槐米中芦丁提取物对O2-·和ABTS+清除能力较弱，而来自槐米中芦丁提取物在质量浓度为0.2 mg/mL～0.8 mg/mL时与芦丁标准品对O2-·和ABTS+的清除能力相当。

3结论与讨论

本试验通过碱提酸沉法提取了槐米中的芦丁并对粗提物进行抗氧化活性的研究，结果表明，与VC相比，芦丁粗提物对·OH自由基清除能力和还原能力较强，但对O2-·和ABTS+自由基清除能力较弱。

已有研究结果表明，当机体内自由基产生过多时，这些自由基如·OH、ABTS、O2-·自由基对DNA、蛋白质和脂质等生物大分子产生氧化损伤作用，引起机体组织器官发生各种病变，尤其·OH自由基可导致基因的变异［7］。有报道表明，槐米提取物对猪油具有较强的抗脂质氧化性能，以及对DPPH自由基和·OH自由基的清除效果较好［8］，与本研究报道的对·OH自由基具有较强的清除效果相一致。从槐花中提取的芦丁对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力较强，其IC50分别为28.39、69.88 μg/mL［9］。这些结果均表明了芦丁具有较好的抗脂质氧化能力及清除自由基的能力。本研究为槐米的开发利用提供理论支持，同时也为槐米中提取的芦丁的抗氧化提供理论参考。

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［9］王胜利，孙金香，席改卿，等.槐花中芦丁超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究［J］.食品工业科技，2012，33（18）:306-381

Rutin Extraction from Sophara Japonica and It Antioxidant Activities

HONG Jun，HU Xiao-wen，WANG Pei，LI Dan-dan
（College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，Henan，China）

To further the development and utilization rutin from sophara japonica，rutin crude extract was obtained using alkaline acid sinking method.Scavenging activities of rutin from sophara japonica on Fe3+reducing power，·OH，O2-·and ABTS radicals using Prussian blue，Salicylic acid，Fenton reaction and ABTS methods were investigated.The results showed that，compared with VC，rutin from sophara japonica had stronger scavenging ability on Fe3+reducing power and·OH radicals，also it had weaker effects on O2-·and ABTS radicals at 0.2 mg/mL-1.0 mg/mL concentrations.

sophara japonica；rutin crude extract；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.005

2014-06-20

河南城建学院博士启动基金

洪军（1977—），女（汉），讲师，博士，主要从事活性物质的提取及多肽的作用机理研究。