脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成工艺优化

王丽君

（淄博职业学院，山东淄博255314）

脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成工艺优化

王丽君

（淄博职业学院，山东淄博255314）

对脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯工艺进行研究。以酯化率为参考指标，考察了在有机介质中不同脂肪酶催化合成亚麻酸枇杷甾醇酯，确定脂肪酶pseudomonas为催化剂。通过响应面分析法确定脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯的最佳工艺，即在正己烷溶剂体系中，脂肪酶用量为7.8%，酸醇摩尔比为2.6∶1，反应温度为50.0℃，反应时间为52.5 h，此时亚麻酸枇杷甾醇酯的酯化率达到79.59%。

亚麻酸枇杷甾醇酯；酶催化；合成；响应面优化

枇杷在我国的产量丰富，枇杷甾醇是其中的功能性成分，具有较好的降低血胆固醇作用［1］。然而枇杷甾醇在脂肪或水中的溶解度较差，限制了它的应用。亚麻酸是人体必须营养素之一，具有提高免疫功能、抗癌、抗糖尿病等功效，但是亚麻酸的氧化稳定性较差［2］。枇杷甾醇与亚麻酸酯化成溶解性较好的甾醇酯，能够在保留两者优良生物活性的同时，有效地解决它们在实际应用中的难题［3］。生物酶法催化合成甾醇酯的条件温和、反应选择性高、能耗低、无溶剂污染，因而受到越来越多的关注。目前，已有学者利用亚麻酸与菜籽甾醇［4］、豆甾醇［5］等植物甾醇催化合成植物甾醇酯的研究，但亚麻酸枇杷甾醇酯的合成还未见报道。因此，本试验在有机介质中，探索不同脂肪酶的催化效果，利用响应面分析法优化脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯的合成工艺条件，以期为枇杷资源开发提供一些理论参考。

1材料及方法

1.1原料与试剂

枇杷甾醇：实验室提供；

亚麻酸：购于青岛诺金化工有限公司；脂肪酶Novozyme435：购于诺维信酶制剂有限公司；脂肪酶pseudomonas：购于丹麦Novo公司；脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6：购于日本Amano公司；脂肪酶Lipase AK：购于美国Sigma公司；

正己烷、二十六烷、乙醇、环己烷、无水乙醚、NaHCO3溶液、硅胶等：淄博职业学院实验室提供。

1.2试验仪器与设备

JJ-160精密增力电动搅拌器：天津腾博实验器材有限公司；GCMS-QP2010SE气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；HH-2恒温水浴锅：上海科鑫机械有限公司，等。

1.3试验方法

1.3.1亚麻酸枇杷甾醇酯的合成［6］

以枇杷甾醇、亚麻酸为原料，脂肪酶作催化剂，将它们溶解于正己烷中，加内标二十六烷，置于连接有电动搅拌器、温度计、油水分离器的三口烧瓶中，水浴加热，开启搅拌器、恒温控制，进行酯交换反应，反应结束后，离心，取上层油状物，冷却，得到亚麻酸枇杷甾醇酯粗品。

1.3.2亚麻酸枇杷甾醇酯的纯化［7］

亚麻酸枇杷甾醇酯粗品经2%NaHCO3溶液和乙醇洗涤，离心，弃下层清夜，上层滤饼加入蒸馏水，除盐，再次离心，滤饼真空干燥至恒重，加环己烷溶解，硅胶柱层析分离，流动相为环己烷/无水乙醚，收集洗脱液，待测。

1.3.3亚麻酸枇杷甾醇酯的气相色谱（GC）分析和酯化率计算

上述纯化后的亚麻酸枇杷甾醇酯用正己烷稀释一定倍数，进行气相色谱分析［8］：

色谱条件：Rxi-17型毛细管色谱柱（15m×0.25mm× 0.25 μm）；FID检测器温度380℃；进样口温度350℃；进样量1.0 μL；载气为高纯度氮气；恒压模式；分流比10∶1；H2流速30 mL/min，柱流速1.0 mL/min，尾吹气氮气，流速20 mL/min。升温程序：初始温度200℃，保持2 min，以3℃/min的速度升至350℃，保持5 min。

酯化率=［1-（W2-W1）］×100%，式中：W1为反应前体系中枇杷甾醇的含量；W2为反应后体系中枇杷甾醇的含量。

1.3.4筛选催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

参考有关文献［9］，分别选取脂肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶LipaseAK这6种酶，在正己烷体系中，亚麻酸为1.0 mmol，枇杷甾醇为1.0 mmol，脂肪酶用量为底物混合物总量的5%，在反应温度为45℃，250 r/min下恒温搅拌48 h。以酯化率为指标，筛选出催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶。

1.3.5脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成工艺的优化

根据单因素试验，选取脂肪酶用量、酸醇摩尔比、反应温度、反应时间4个因素的最优试验范围，以酯化率为优化指标，采用响应面分析法对脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成工艺条件进行优化。

2结果与分析

2.1筛选催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的脂肪酶

分别选取肪酶Novozyme435、脂肪酶pseudomonas、脂肪酶AYS、脂肪酶AY-30G、脂肪酶A6、脂肪酶Lipase AK，按照1.3.1方法进行亚麻酸枇杷甾醇酯的合成，不同脂肪酶对催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的酯化率影响结果如图1所示。

图1　脂肪酶种类对酯化率的影响Fig.1Influence of different kinds of lipase on the yield of esterification

由图1可知，当脂肪酶pseudomonas作为催化剂时，酯化率值较高。这是可能是由于脂肪酶pseudomonas以高催化速率水解不溶于水的长链酯类化合物而促进亚麻酸枇杷甾醇酯的合成，提高了酯化率。因此，选择脂肪酶pseudomonas作为催化剂。

2.2脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成工艺的优化试验

2.2.1脂肪酶用量对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响

设定合成亚麻酸枇杷甾醇酯时，酸醇摩尔比为3∶1，反应温度为50℃，反应时间为24 h，分别在脂肪酶用量为2%、4%、6%、8%、10%、12%6个梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亚麻酸枇杷甾醇酯并测其酯化率，脂肪酶用量对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响结果如图2所示。

图2　脂肪酶用量对酯化率的影响Fig.2Effect of enzyme amount on the yield of esterification

由图2可以看出，当脂肪酶用量为8%，酯化率达到最大且之后逐渐减小。因此，脂肪酶酶催化合成亚麻酸枇杷甾醇酯的最佳脂肪酶用量为8%。

2.2.2酸醇摩尔比对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响

设定合成亚麻酸枇杷甾醇酯时，脂肪酶用量为8%，反应温度为50℃，反应时间为24 h，分别在酸醇摩尔比为1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1 6个梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亚麻酸枇杷甾醇酯并测其酯化率，酸醇摩尔比对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响如图3所示。

图3　酸醇摩尔比对酯化率的影响Fig.3Effect of molar ratio of linolenate to phytosterol on the yield of esterification

由图3可以看出，当酸醇摩尔比为3∶1时，酯化率达到最大。因此，选择合成亚麻酸枇杷甾醇酯的酸醇摩尔比为3∶1。

2.2.3反应温度对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响

设定合成亚麻酸枇杷甾醇酯时，脂肪酶用量为8%，酸醇摩尔比为3∶1，反应时间为24 h，分别在反应温度为40、45、50、55、60、65℃6个梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亚麻酸枇杷甾醇酯并测其酯化率，反应温度对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响如图4所示。

图4　反应温度对酯化率的影响Fig.4Effect of reaction temperature on the yield of esterification

由图4可以看出，当反应温度为50℃时，亚麻酸枇杷甾醇酯合成效果较好。

2.2.4反应时间对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响

设定合成亚麻酸枇杷甾醇酯时，脂肪酶用量为8%，酸醇摩尔比为3∶1，反应温度为50℃，分别在反应时间为12、24、36、48、60、72 h 6个梯度下，按1.3.1和1.3.2合成亚麻酸枇杷甾醇酯并测其酯化率，反应时间对合成亚麻酸枇杷甾醇酯效果的影响如图5所示。

由图5可以看出，当反应时间为48 h时，亚麻酸枇杷甾醇酯合成效果较好。

图5　反应时间对酯化率的影响Fig.5Effect of reaction time on the yield of esterification

2.2.5脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的条件优化

结合单因素试验的结果，分别选取脂肪酶用量为6%、8%、10%，酸醇摩尔比为1∶1、3∶1、5∶1，反应温度为45、50、55℃，反应时间为36、48、60 h，利用响应面分析法优化脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺参数。响应面实验因素水平见表1，结果见表2，回归方程各项的方差分析见表3。

表1　响应面因素水平Table 1Response surface factors level and coding

表2　脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成试验设计及结果Table 2Test design and results of catalyzed synthesis of phytosterol linolenate esters

表3　回归方程各项的方差分析Table 3The variance analysis of regression equation

对脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成条件进行分析，脂肪酶用量，酸醇摩尔比、反应温度、反应时间都是显著因素。关于亚麻酸枇杷甾醇酯的酯化率二次回归拟合方程：

酯化率/%=77.20-2.85×A-2.57×B-2.40×C+ 5.41×D+8.57×A×B+4.46×A×C-2.52×A×D-0.66×B×C-4.43×B×D+1.61×C×D-8.09×A2-5.66×B2-3.29×C2-4.48× D2（式中：A为脂肪酶用量，B为酸醇摩尔比C为反应温度；D为反应时间。）

由表3可以看出，模型的P值为＜0.000 1，而失拟项的P值为0.060 6，说明了脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的模型与实际情况拟合程度比较好，可以预测脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的条件。

由方差分析结果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都显著，相应曲面图见图6至图11。

根据脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的试验结果和回归方程各项的方差分析，由响应面分析法优化出脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺条件，即脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺条件为脂肪酶用量为7.8%，酸醇摩尔比为2.6∶1，反应温度为50.0℃，反应时间为52.5 h。

图6　脂肪酶用量与酸醇摩尔比交互作用对酯化率影响的响应面Fig.6Response surface of effect of enzyme amount and molar ratio of linolenate to phytosterol interaction on the yield of esterification

图7　脂肪酶用量与反应温度交互作用对酯化率影响的响应面Fig.7Response surface of effect of enzyme amount and reaction temperature interaction on the yield of esterification

图8　脂肪酶用量与反应时间交互作用对酯化率影响的响应面Fig.8Response surface of effect of enzyme amount and reaction time interaction on the yield of esterification

2.2.6验证试验

为验证响应面分析法优化出脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺条件的可靠性，根据响应面优化条件验证试验设计表（表4）进行验证试验。由表4可知，试验5的亚麻酸枇杷甾醇酯的酯化率最高，因此脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺条件为脂肪酶用量为7.8%，酸醇摩尔比为2.6∶1，反应温度为50.0℃，反应时间为52.5 h。

图9　酸醇摩尔比与反应温度交互作用对酯化率影响的响应面Fig.9Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction temperature interaction on the yield of esterification

图10　酸醇摩尔比与反应时间交互作用对酯化率影响的响应面Fig.10Response surface of effect of molar ratio of linolenate to phytosterol and reaction time interaction on the yield of esterification

图11　反应温度与反应时间交互作用对酯化率影响的响应面Fig.11Response surface of effect of reaction temperature and reaction time interaction on the yield of esterification

表4　响应面优化条件验证试验设计表Table 4Response surface optimization condition verification test design table

3结论

响应面优化脂肪酶催化亚麻酸枇杷甾醇酯合成的最佳工艺条件为：脂肪酶pseudomonas为催化剂，在正己烷溶剂体系中，脂肪酶用量为7.8%，酸醇摩尔比为2.6∶1，反应温度为50.0℃，反应时间为52.5 h，此时亚麻酸枇杷甾醇酯的酯化率达到79.59%。

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Optimization of Lipase Catalyzed Synthesis of Phytosterol Linolenate Esters

WANG Li-jun
（ZiBo Vocational Institute，Zibo 255314，Shandong，China）

This study mainly discussed the synthesis technology of phytosterol linolenate esters with lipase.With the yield of esterification of phytosterol linolenate esters as indicator，phytosterol linolenate esters were synthesis by using various lipases in organic media，and the lipase pseudomonas was selected for the best biocatalysts. The optimum synthesis conditions of phytosterol linolenate esters with lipase were determined by the response surface methodology，such as enzyme amount for 7.8%，molar ratio of linolenate to phytosterol for 2.6∶1，reaction temperature for 50.0℃，reaction time for 52.5 h in the n-hexane solvent systems，and the esterification of phytosterol linolenate esters reaches 79.59%.

phytosterol linolenate esters；lipase-catalyzed；synthesis；response surface optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.019

2014-11-19

王丽君（1972—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：精细化学品及化学工程。