紫树莓叶中黄酮提取条件的优化

罗建成，李杰，熊鹏

（南阳理工学院生化学院，河南南阳473004）

紫树莓叶中黄酮提取条件的优化

罗建成，李杰，熊鹏

（南阳理工学院生化学院，河南南阳473004）

采用响应面分析优化有机溶剂提取树莓叶中总黄酮的工艺。在用有机溶剂提取工艺中，紫树莓叶黄酮提取工艺最佳工艺条件：采用乙醇为溶剂、乙醇浓度为57.8%、提取温度62.1℃、提取时间92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。对实验优化条件进行验证得到提取率为12.56%。

紫树莓叶；黄酮；条件优化；响应面分析法

树莓属蔷薇科蔷薇亚科悬钩子属中的一种落叶灌木的成熟果实，又名托盘、马林、覆盆子等［1］，树莓的药用价值有详细记载。树莓全株入药，有补肝肾、缩小便、助阳、固精之功效。民间用于治疗腹泻、目赤、酒精中毒等［2］。在树莓叶片中起主要作用的是黄酮类物质。据相关文献报道，树莓叶中黄酮含量要远高于树莓果和籽。徐雅琴等的研究证实［3］：树莓叶中含有丰富的黄酮类物质，黄酮类化合物是植物界分布较广的一大类多酚类物质，常以游离或糖苷形式存在于植物体内，是一类具有显著生理药理活性和开发前景的植物成分，其中山奈酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）［4-5］具有明显的抗癌、抗氧化，抗心肌肥厚功能，并能促进骨髓中成骨细胞的形成。树莓叶提取物粗黄酮具有一定的抗氧化作用［3］。树莓叶提取物粗黄酮对DPPH·有较好的清除作用，且随剂量的增加清除作用增强。

由于树莓叶黄酮类化合物多具有游离的酚羟基，一般情况易溶于碱性溶液和极性较大的有机溶剂，大多数以黄酮苷的形式存在，其易溶于水、含水乙醇、甲醇等极性溶剂，少数以黄酮苷元的形式存在。黄酮类化合物性质之间差别较大，每种树莓叶中所含的杂质又不完全相同，因此尚无一个通用的提取方法。目前的提取方法主要有以下几种：有机溶剂提取、碱性稀醇或碱性水提取、超声提取、微波提取、超临界萃取、酶解提取、超滤法等方法［6-13］，再对粗提物进行精制、纯化处理。利用响应面分析法优化有机溶剂提取树莓叶中的黄酮提取工艺鲜报道。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

紫树莓叶：河南南阳市产。

1.1.2仪器

HHS-6电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；BS110S电子天平：德国（北京）赛多利斯天平有限公司；TDL-40B台式离心：上海申光仪器仪表有限公司；FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；101A-2电热鼓风干燥箱机：上海申光仪器仪表有限公司；721 N分光光度计：上海精密仪器有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器：金坛市杰瑞尔电器游戏公司。

1.1.3试剂

芦丁标准品，甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、硝酸铝、乙酸乙酯和氢氧化钠均为分析纯且均为天津金汇太亚化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1紫树莓叶黄酮的提取

黄酮成分粗提时的工艺流程：清洗→干燥→黄酮粗提物

1.2.2芦丁标准曲线的绘制

准确称取经105℃烘干至恒重的芦丁标准品15 mg，用80%乙醇溶解定容100 mL容量瓶，得到0.15 mg/mL的芦丁标准液，精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的芦丁标准液分别于7个洁净的25 mL容量瓶中，分别加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL的80%乙醇溶液，然后向每个容量瓶中各加入5% NaNO2溶液1.0 mL充分振荡后静置6 min，再向每个容量瓶中加入10%Al（NO3）3［14］溶液1.0 mL，充分振荡后静置6 min，向每个容量瓶中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至25 mL容量瓶刻度处，充分振荡后静置15 min，在507 nm处测吸光度。

1.2.3样品测定及提取率的计算

1.2.3.1样品测定方法

提取液离心以后在50 mL的容量瓶定容。精密吸取10 mL溶液，在20 mL的刻度试管中定容。从刻度试管中精密吸取稀释后的溶液6mL，放入另一备用20mL的刻度试管；然后向每个刻度试管中各加入5%NaNO2溶液1.0 mL充分振荡后静置6 min，再向每个刻度试管中加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振荡后静置6 min，向每个刻度试管中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至20 mL，充分振荡后静置15 min，在507 nm处测吸光度。

1.2.3.2黄酮提取率的计算

利用标准曲线方程计算出提取物的重量，其公式可整理成：

x=（0.8y-0.007 8）/0.339 5

式中：y为测得的吸光度值；x为由标准曲线方程计算出提取物的重量。

提取率=提取物的重量/紫树莓叶的重量×100%

由于本次试验黄酮含量一般，所以在测量时提取液稀释20倍，则黄酮提取率的计算公式为：η%=x× 20×50×100/6×1 000

1.3不同因素对紫树霉叶中黄酮类化合物提取工艺的影响

1.3.1不同提取溶剂对黄酮提取率的影响

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在料液比为1∶50（g/mL），分别采用不同的提取溶剂，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.2不同溶剂浓度对黄酮提取率的影响

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在乙醇作为提取溶剂，乙醇浓度分别为：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比为1∶50（g/mL），60℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.3不同提取温度对黄酮提取率的影响

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在60%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50（g/mL），振荡速度120 r/min，在不同温度下提取2 h，提取温度分别为：40、50、60、70、80℃。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.4提取时间对黄酮提取率的影响

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在60%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取，提取时间分别为：60、90、120、150、180 min。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.5提取溶剂的料液比对黄酮提取率的影响

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在60%乙醇作为提取溶剂，60℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.6响应面分析

据Box-Behnken的中心组合试验设计原理［15］，综合单因素试验所得结果，3个对黄酮提取率影响显著的因素，分别以A、B和C为代表，每一个自变量的试验水平分别以－1、0、1进行编码0代表最高水平、-1为最高水平左面的水平、1为最高水平右面水平。以紫树莓叶黄酮提取率为响应值（Y），在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计。对得出的结果进行验证。

2结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

根据数据得到芦丁含量和吸光度值之间标准曲线如图1。

图1　芦丁标准品标准溶液在507 nm处标准曲线Fig.1Rutin standard standard solution at 507 nm standard curve

通过一元线性回归方程为：y=0.339 5x+0.007 8。式中：y为507 nm处的吸光度值；x为黄酮的含量，mg；经过计算，相关系数为：R2=0.997 5，回归极显著。所以在芦丁含量为0～0.9 mg的范围内，是可以用该方法检测黄酮含量的。

2.2最佳溶剂选择

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在料液比为1∶50（g/mL），分别采用不同的提取溶剂，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀释20倍后按1.2.3.1给出的方法测量。实验结果数据如表1。

表1　不同溶剂的黄酮提取率Table 1Different solvents of flavonoids extraction yield

由表1可知使用不同溶剂，树莓叶中黄酮的提取率不同，由上表可知乙醇的提取率最大。

2.3最佳浓度选择

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在乙醇作为提取溶剂，乙醇浓度分别为：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比为1∶50（g/mL），60℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀释20倍后按1.2.3.1给出的方法测量。实验结果数据如表2。

由表2可知随着乙醇浓度的增加，提取率由大变小，在60%乙醇浓度下提取率达到最大。

表2　不同浓度的黄酮提取率Table 2Different concentrations of flavonoids extraction yield

2.4最佳温度选择实验结果

分别准确称取1.0 g紫树霉叶粉末，在60%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50（g/mL），振荡速度120r/min，在不同温度下提取2 h，提取温度分别为：40、50、60、70、80℃。提取液离心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀释20倍后按1.2.3.1给出的方法测量。实验结果数据如表3。

表3　不同温度的黄酮提取率Table 3The flavonoids extraction rate of different temperature

由表3知在开始随温度越大提取率越高，之后反而下降，分析有可能高温使黄酮受到了破坏。因此实验选取60℃为合适温度条件。

2.5最佳时间选择

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在60%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取，提取时间分别为：10、20、30、40、50 min。提取液离心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀释20倍后按1.2.3.1给的方法测量。实验结果数据如表4。

表4　不同提取时间的黄酮提取率Table 4Different extracting flavonoids extraction yield of time

由表4知最开始提取时间长提取率越高，但在120 min之后反而越小，分析有可能是树莓叶中黄酮比较容易提取，时间越长提取出来的其他物质较多，和黄酮结合成了其他物质，还有就是黄酮被氧化，因此实验选取提取时间为120 min。

2.6最佳料液比选择实验结果

分别准确称取1.0 g紫树莓叶粉末，在60%乙醇作为提取溶剂，60℃水浴，振荡速度120 r/min条件下提取2 h，料液比分别为：1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。提取液离心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀释20倍后按1.2.3.1给出的方法测量。实验结果数据如表5。

表5　不同料液比的黄酮提取率Table 5Different material liquid ratio of flavonoids extraction yield

由表5知料液比与提取率关系为料液比越大越好，但是在1∶50之后提取率增长不明显，考虑成本因素实验选取1∶50（g/mL）作为实验的料液比。

2.7响应面分析

据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验所得结果，确定料液比为1∶50（g/mL），选取乙醇浓度、提取时间、提取温度3个对黄酮提取率影响显著的因素，以紫树莓叶黄酮提取率为响应值（Y），在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表6。

表6　响应面分析因素与水平Table 6The response surface analysis of factors and levels

对乙醇浓度A、提取时间B和提取温度C作变换如下：A=（Z-60）/10，B=（t－90）/30，C=（T－60）/10（Z、t、T分别为试验乙醇浓度、提取时间及提取温度）以A、B、C为自变量，以3次试验所得多糖提取率的平均值为响应值（Y），结果见表7，其中1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计试验误差。

表7　响应面分析方案及结果Table 7The response surface analysis methods and results

由表7的Box-Behnken试验设计及结果，用SAS统计分析软件进行二次多项回归拟合，可建立二次响应面的回归分析模型，提取率的估计回归系数如表8，整理后的二次回归方程如下：Y=11.880 3-0.451 5A-0.1422 5B+0.181 5C+0.167A×B-0.324A×C-0.294 5B× C-0.800 667A2-0.555 167B2-0.692 167C2，R值为0.964 8＞0.9方法可靠。

表8　提取率的估计回归系数Table 8Extraction yield estimates of regression coefficient

表9　提取率的方差分析Table 9The extraction yield of analysis of variance

由回归方程的方差分析表8、9可知，模型一次项A显著，二次项A2极显著，B2、C2显著，交互项都不显著。说明3个因素之间的交互作用对试验结果的影响不显著。回归方程的F值为19.84，大于F值的概率（Pr＞F）为0.048，显示该方程的回归显著。

由图2至图4可知，提取溶剂浓度、提取时间和温度对树莓叶中的黄酮提取的效应，有一个极值点，两个不同因素间的交互作用黄铜的提取影响不是简单的线性关系。所建立的模型在进行的试验范围之内有一稳定点，稳定点即是极大值所在的点。

为求出基础黄酮提取的优化条件和优化条件所对应的黄酮提取率的最大理论值，对所建立的回归方程中的变量A、B、C分别求其一阶偏导，并令其等于零，可得三元一次方程组，对此方程组进行求解，可得A=－0.214 345 66，B=0.091 685 11，C=0.206 138 93，代入前述的变换公式得到乙醇浓度57.8%、提取时间为92.7 min、提取温度62.1℃。计算理论优化提取率为12.48%，按照上述条件即紫树莓叶黄酮提取工艺最佳工艺条件为采用乙醇为溶剂、乙醇浓度为57.8%、提取温度62.1℃、提取时间92.7 min、料液比1∶50（g/mL）实验条件进行验证得到提取率为12.56%，实测平均值与预测值拟合较好，因此，模型能很好地预测真实的提取情况。

图2　乙醇浓度（A）与提取时间（B）的响应面图Fig.2Extraction yield and ethanol concentration，extraction of the surface figure of the time

图3　乙醇浓度（A）与提取温度（C）的响应面图Fig.3Extraction yield and ethanol concentration，extraction temperature of the surface figure

图4　提取时间（B）与提取温度（C）的响应面图Fig.4Extraction yield and extraction time，extraction temperature of the surface figure

3结论

在用有机溶剂提取工艺中，紫树莓叶黄酮提取工艺最佳工艺条件为采用乙醇为溶剂、乙醇浓度为57.8%、提取温度62.1℃、提取时间92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。对实验优化条件进行验证得到提取率为12.56%。

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Optimization of Extraction Conditions of Purple Raspberry Leaf Flavonoids

LUO Jian-cheng，LI Jie，XIONG Peng

（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Organic solvent extraction of raspberry was optimized by using response surface analysis technology of total flavonoids in the leaves.In organic solvent extraction process，purple raspberry leaf flavonoids extraction process optimum technological conditions for using ethanol as solvent，57.8%ethanol concentration，extraction temperature 62.1℃，the extracting time 92.7 min，material liquid than 1∶50（g/mL）.The experimental optimization conditions were verified，the extraction yield could reach 12.56%under these conditions.

purple raspberry leaf；flavonoid；conditions optimization；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.010

2015-02-06

罗建成（1965—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：生物技术。