羟乙基-β-环糊精微波协同提取山楂中花青素的研究

李志英，董晶，张姝

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

羟乙基-β-环糊精微波协同提取山楂中花青素的研究

李志英，董晶，张姝

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

以羟乙基-β-环糊精的乙醇溶液为提取介质，用微波辅助提取山楂中的花青素，用紫外分光光度法测定山楂中的花青素的得率。在单因素试验的基础上，采用正交试验的方法。研究表明最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为60%，微波功率为325 W微波提取时间为120 s，料液比（g/mL）1∶10，羟乙基-β-环糊精的用量m（山楂）∶m（羟乙基-β-环糊精）为1∶0.8。正交试验优化结果为：功率为260 W，微波时间为90 s，料液比为1∶20。在优化条件下提取山楂中花青素的得率为：3.35 mg/g。羟乙基-β-环糊精的加入，有效提高了花青素的得率。

山楂；花青素；羟乙基-β-环糊精；微波提取

山楂为蔷薇科植物山楂或野山楂的果实，在我国资源丰富。山楂以果实入药，是卫生部批准的药食两用食物，广泛应用于保健食品和药剂中。山楂具有消食健胃和行气散瘀的功能［1］，近代研究结果表明，山植中含有丰富的有机酸、黄酮类、多酚类成分、三菇酸、维生素C、果胶、糖类、多种微量元素和矿物质，这些化合物有多方面的药理作用［2］。

原花青素是清除自由基很强的抗氧化剂，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，能防治多种因自由基引起的疾病包括心脏病、关节炎等。此外，原花青素还具有改善人体微循环功能，改善视觉功能，预防心脑血管疾病，抗辐射，抗肿瘤等多种功能［3］。

微波萃取是近年来发展起来的新技术，其最大特点是作用时间短，速度快，提取效率高，适用范围广［4］。国外关于提取花青素的报道很多［5］，一般采用水煮法和溶剂提取法［6］。水煮法耗能大，操作困难。溶剂提取法得率高，但成本高且安全性低，更可能造成环境污染。近年来，微波技术以其促进反应的高效性和选择性加热、操作简便、副产物少、产率高及产物易于提纯等优点，已应用于有机合成、酯化等反应中，目前也有文献报道用于天然产物的提取［7］。本论文对山楂中花青素的羟乙基-β-环糊精微波协同提取工艺进行了研究，为天然抗氧化剂提供一定的科学参考。

1试验与方法

1.1仪器与试剂

UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；分光光度计（723#）：上海光谱仪器有限公司；LG型家用微波炉：天津市东金电子电器有限公司；电子分析天平（AL104）：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；中草药粉碎机（FW135型）：天津市泰斯特仪器有限公司；60目筛：浙江省上虞市纱筛厂制造；HK-1D型恒温水浴锅：南京大学应用物理研究所。

山楂（购于忻州市五台山药店）去除杂质，用粉碎机粉碎，过60目筛，得到山楂粉末，装瓶待用。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2溶液的配制

原花青素标准品（分析纯，四川省维克寄生物科技有限公司）：准确称取10 mg花青素标准品定溶于10 mL甲醇中得到1 mg/mL的标准溶液；香草醛-甲醇溶液：称取10.000 g香草醛溶于甲醇溶液中，定容到250 mL，得到40 mg/mL的香草醛-甲醇溶液。

1.3山楂中花青素的提取

称取1.0 g山楂样品于圆底烧瓶中，分别加入0.8 g羟乙基-β-环糊精，然后加入60%的乙醇10 mL，在微波功率为325 W下辐射120 s，提取液定容至50 mL容量瓶，过滤，留上清液待测。

1.4山楂中花青素含量的测定

精确吸取样品提取液1.0 mL于10 mL比色管中，加入浓度为40 mg/mL的香草醛-甲醇溶液6.0 mL和浓盐酸3.0 mL，定容到10 mL，恒温（30℃）避光反应30 min，以香草醛-甲醇溶液∶浓盐酸∶60%乙醇=6∶3∶1（体积比）的混合溶液作对照，在紫外分光光度计上测得波长505 nm处的吸光度值A505nm得率=（cV× 103）f/W×100%，式中：V为定容体积，mL；c为花青素提取液浓度，（μg/mL）；f为稀释因子；W为山楂粉末的质量。

2结果与讨论

2.1最大吸收波长

取10 mL比色管3支，各加入1 mL的1 mg/mL花青素标准液，60%乙醇提取液，60%乙醇+羟乙基-β-环糊精提取液，按1.4的试验方法，以未加对照品的试剂空白作参比，于波长400 nm～800 nm处测定吸收谱，结果见图1。

图1花青素提取液与花青素标准品吸收光谱比较Fig.1Camparison of absorption spectrum of anthocyanin extracts and anthocyanin standard

图1中，曲线1为乙醇+羟乙基-β-环糊精提取反应液，曲线2为乙醇提取反应液，曲线3为花青素标准品反应液，三者均在505 nm处有最大吸收波长，且加入羟乙基-β-环糊精对最大吸收波长无影响，以羟乙基-β-环糊精为提取介质增加了花青素的得率。

2.2花青素标准曲线的测定［8］

准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的花青素标准溶液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法，在505 nm下测定其吸光度值。得回归方程为：y=11.075x+0.029 3，r=0.999 0。试验测得花青素标准溶液浓度在0.01mg/mL～0.1 mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.3提取介质的选择

称取1.0 g山楂4份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取提取介质分别为10 mL蒸馏水、10 mL 60%乙醇、10 mL 60%乙醇+1.0 g β-环糊精、10 mL 60%乙醇+1.0 g羟乙基-β-环糊精，得提取液，按1.4的试验方法测定花青素的得率。结果如表1。

表1　提取介质对花青素得率的影响Table 1Effect of extraction medium on the yield of anthocyanins

如表1所示，以羟乙基-β-环糊精为提取介质山楂中花青素的得率最高，因此本试验选择羟乙基-β-环糊精为花青素的提取介质。

2.4羟乙基-β-环糊精用量对花青素得率的影响

称取1.0 g山楂样品5份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取羟乙基-β-环糊精的用量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g，得提取液，精确吸取样品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法测定，结果如表2。

表2　羟乙基-β-环糊精用量对花青素得率的影响Table 2Effect of Hydroxyethyl-β-cyclodextrin amount on the yield of anthocyanins

由表2说明，随着羟乙基-β-环糊精用量增加，花青素得率也增加，当羟乙基-β-环糊精用量大于0.8 g时得率有下降趋势，因此选取羟乙基-β-环糊精用量为0.8 g进行正交试验为宜。

2.5微波功率对花青素得率的影响

称取1.0 g山楂样品5份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取提取功率分别为195、260、325、390、455 W，得提取液，精确吸取样品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法测定，结果如表3。

表3　微波功率对花青素得率的影响Table 3Effect of microwave power on the yield of anthocyanins

由表3说明，随着微波功率增大，花青素得率增大，当微波功率超过325 W时得率明显下降，可能因为功率大时造成花青素的结构发生变化，甚至是碳环裂解，导致得率降低，因此选取微波功率为325 W进行正交试验为宜。

2.6料液比对花青素得率的影响

称取1.0g山楂样品5份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL，得提取液，精确吸取样品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法测定，结果如表4。

由表4可知，随料液比增加，花青素得率增大，当料液比大于1∶10时，得率逐渐下降，因此选取料液比1∶10进行正交试验为宜。

2.7微波得时间对花青素得率的影响

称取1.0 g山楂样品5份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取提取时间分别为90、120、150、180、200s，得提取液，精确吸取样品1.0mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法测定，结果如表5。

表4　料液比对花青素得率的影响Table 4Effect of ratio of material to liquid on the yield of anthocyanins

表5　微波时间对花青素得率的影响Table 5Effect of time on the yield of anthocyanins

由表5的试验数据说明，当提取时间大于120s时，得率逐渐下降，可能因为时间长温度高破坏了花青素的结构，导致得率的下降，因此选取微波提取时间为120 s进行正交试验为宜。

2.8乙醇浓度对花青素得率的影响

称取1.0g山楂样品5份于圆底烧瓶中，按1.3的试验方法，固定其它条件不变，选取乙醇溶液浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%得提取液，精确吸取样品1.0 mL提取液于10 mL比色管中，按1.4的试验方法测定，结果如表6。

表6　乙醇浓度对花青素得率的影响Table6Effectofethanolconcentrationontheyieldofanthocyanins

由表6的试验数据说明，随着乙醇浓度增加花青素得率增加，当乙醇浓度大于60%时，得率有下降趋势，考虑节省药品及得率，因此选取乙醇浓度为60%进行正交试验为宜。

2.9正交试验

在单因素试验的基础上，选定微波功率、微波辅助提取时间和料液比进行优化组合，以所测得率为考查指标，进行正交试验，优选出提取花青素的最佳工艺参数。

表7　正交试验因素水平Table 7Factor and levels of the orthogonal experiment

表8　微波法正交试验极差结果分析表Table 8The orthogonal experiment design and result analysis

由表8中极差R值分析可知各因素影响大小顺序为C（提取时间）＞B（功率）＞A（料液比），最佳试验方案是A3B1C1即最佳的提取工艺为微波功率为260 W，微波时间为90 s，料液比为1∶20（mg/g）。

2.10不同提取条件比较试验

分别称取1.0 g山楂样品两份于两个圆底烧瓶中，一份加入0.8 g羟乙基-β-环糊精，然后加入60%的乙醇10 mL，在微波功率为325 W下辐射120 s，另一份加入0.8 g羟乙基-β-环糊精，然后加入60%的乙醇20 mL，在微波功率为260 W下辐射90 s，提取液分别定容至50 mL容量瓶，过滤，按1.4的试验方法测定。得率分别为3.35 mg/g和3.34 mg/g，二者相差不大。

2.11对DPPH的清除作用的比较

取1.0 g山楂样品和0.8 g羟乙基-β-环糊精于圆底烧瓶中，在最佳条件下进行微波提取，得花青素提取液，按1.3的试验方法提取，按1.4的试验方法测定其吸收光谱，根据标准曲线计算花青素的浓度。然后分别配制与花青素浓度相等的芦丁溶液和VC溶液。用DPPH法［9］检测上述三种溶液的抗氧化性。分别各取上述三种溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管中，各加入0.5 mg/mL的DPPH溶液1 mL，定容，静置30 min后，在波长517 nm处测定其吸光度，计算得率。结果如图2。

图2　对DPPH的清除作用的比较Fig.2Comparison of scavenging effect on the DPPH

由图2中曲线1可知，羟乙基-β-环糊精对DPPH无清除作用。由2、3、4曲线可知，三种溶液浓度相等的情况下，花青素的抗氧化性远远大于芦丁和VC，而芦丁的抗氧化性又比VC小，说明花青素是很强的抗氧化剂，因此能治疗多种因自由基引发的疾病。

［1］孙敬勇，杨书斌，谢鸿霞，等.山楂化学成分研究［J］.中草药，2002，33（60）:483-486

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Study on the Microwave-β-CD Assisted Extraction Anthocyanins from Crataegus

LI Zhi-ying，DONG Jing，ZHANG Shu
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Microware method was used to extract the anthocyanins from Crataegus with the hydroxyethyl-β-CD-ethanol as medium.The yield of the anthocyanins was determined by UV-spectrophotometry.The optimum extraction conditions were investigated through orthogonal test according to single factor experiment.The optimum extraction conditions of single factor experiment were obtained as follows：ethanol concentration 60%，microwave power 325 W，extraction time 120 s，solid to liquid ratio 1∶10 and the mass ratio of crataegus with β-CD was 1∶0.8.Under the optimum conditions，the orthogonal test was obtained as follows：microwave power 260 W，extraction time 90 s，solid to liquid ratio of 1∶20.The yield of anthocyanins was obviously increased in the presence of β-CD and 3.35 mg/g was reached.The yield of anthocyanins was improved through the addition of hydroxyethyl-β-cyclodextrin.

crataegus；anthocyanins；hydroxyethyl-β-CD；microwave extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.009

2014-03-13

忻州师范学院应用化学创新实践基地（院政字201331）；忻州师范学院大学生科技创新项目（2012.1022）

李志英（1970—），女（汉），教授，硕士，从事分析化学教学与科研工作。