植物药甘草中晶纤维的显微定量研究*

杨智峰　高玉娟　李敬梅

陕西省中医药研究院(西安 710003)



植物药甘草中晶纤维的显微定量研究*

杨智峰高玉娟李敬梅△

陕西省中医药研究院(西安 710003)

目的：改进植物药甘草中晶纤维显微定量的方法。方法：在已有显微定量方法的基础上，以混悬制样代替“水飞”制样，以血球计数板代替普通载玻片。利用线性分析方法确定取样量，用正交实验方法，优化制片用混悬液配比和定量需要观察制片的数量，进行混悬液稳定性考察，确定实验用时。结果：样品细度要求100目，样品定量需制片10张；混悬剂：由60%稀甘油和水合氯醛试液组成，比例19∶1；神木产甘草显微特征均数：1498±22个/mg。结论：引用血球计数板，提高显微定量的易操作性和准确性。

药材显微定量是利用药材中某种显微特征，通过显微计数，进行原药材含量测定的方法，如：甘草中的晶纤维、红花中花粉粒等。这方面的工作，苑冬梅、康廷国教授研究的较多，应用于中成药(全粉末或部分粉末制剂)组分定量、中药炮制和调料质量控制，用混悬剂以“水飞”方法制样，利用传统载玻片、盖玻片、微量进样器、网格式测微尺和显微镜进行，每个样品制片5～10张,理论根据在于单位药材样品显微特征个数是一常数[1-2]。其缺点在于：“水飞”方法制样，误差较大，显微注样器的孔径能否满足要求，定量溶液制片不易操作，全盖玻片观察计数困难很大、误差不易控制，局部计数，计数体积难以确定，因此，该法需要完善。我们以甘草中晶纤维为对象，对以往显微定量方法进行了改进。用混悬剂定量混悬的方法制样，利用血球计数板、盖玻片、定量滴管和显微镜进行，理论根据同上，希望以此提高显微定量法的精度，便于应用。

1　仪器和试药

BS210S分析天平，Olmypus双目显微镜(日本)，LeicaMD750双目显微镜(德国)，烘箱，血球计数板。甘油(化学纯)、水合氯醛(分析纯)和蒸馏水。

2　方法与结果

2.1试验参数和计算样品细度：由于血球计数板空间高度为0.1mm，即100μm，故样品粉碎细度应为100目。血球计数板样品池充液量：经测量和计算一个样品池需混悬液约0.02mL。滴管液滴大小考察：取滴管，吸取1mL混悬液，10次，记录1mL混悬液滴出液滴的数量，并记录之，经计算1滴约4.6×10-3mL，能满足样品池充液要求。样品计数显微特征的确定：计数显微特征在实验时间内稳定，形态上没有变化，如：部分溶解，同时，要易于观察。显微特征常数的计算：由于血球计数板一个样品池中大方格体积为0.4mm3，计数仅计大方格中显微特征个数，若以n张片子中显微特征个数(X)为基数，则10mL样品液中显微特征个数(Y)的计算公式：Y=1.25×104x/n。若10mL样品混悬液中有药材质量(M)mg，则该药材显微特征常数(K)：K=Y/M(个/mg)。

2.2实验要求样品粉碎:取样品药材，闷润，切片，65℃烘干，冲筒粉碎，不留残渣，过100目筛，细粉备用。制样:取样品粉末适量(多在100mg以下)，加水合氯醛液适量，再加一定浓度的稀甘油适量，振摇混悬，定容于10mL容量瓶中，振摇混匀，备用。制片:用验证过的滴管(1mL溶液，滴20滴左右)，滴1滴，注入盖有盖玻片的血球计数板样品池中，两个样品池各1滴，注满，1次做够所需片数。显微观察:每个样品制片，观察、记录每个样品池大方格中显微特征个数，20个数据，因每个计数板有两个样品池。要求2h内完成，此由计数显微特征在混悬液中的稳定性决定。

2.3实验方法

2.3.1混悬液稳定性实验:取样品适量(陕西神木甘草，批号：20120826，51.5mg)，加混悬液(由60%稀甘油和水合氯醛试液组成，比例19︰1)，定容于10mL容量瓶中，摇匀，每隔20min，制片1次，每次10张，比较前后计数情况(76250、76250、76250、76250、77500、7500)，变异系数：0.95%，确定溶液稳定的时间为2h。

2.3.2线性范围考察:取样品(陕西神木甘草，批号：20120826，下同)42.3、51.9、60.9、71.9、82.6、91.1、102.6mg，用60%稀甘油和水合氯醛试液，定容于10mL容量中，配比19︰1，各样品制片10张，记录显微特征个数，进行单位质量与显微特征个数关系的回归分析，计算相关系数：r=0.9967，与相关系数临界值相比，高度相关，回归方程：Y=423.43X+1.22×105，线性范围应在40mg～100mg。

2.3.3制片影响因素的考察和结论：从预实验情况看，影响显微特征计数的因素有稀甘油浓度、稀甘油与水合氯醛试液配比和观察片子的数量。故进行四因素三水平正交实验，样品细度100目，取样量50mg～60mg，实验因素和水平安排见表1，实验安排、实验数据和极差分析见表2。正交实验取样量：1#，52.1mg；2#，50.3mg；3#，59.1mg；4#，54.8mg；5#，52.4mg；6#，52.4mg；7#，57.0mg；8#，54.9mg；9#，56.1mg。从方差分析情况可知：实验用甘油溶液浓度，对显微特征常数确定影响非常显著，观察片数对其影响显著，综合极差和用时情况，最终确定显微定量方法：取样，称量，用60%甘油溶液和水合氯醛试液(19∶1)混悬，用血球计数板制片10张；观察，计算即可。

表1　　实验因素和水平安排

表2　　正交实验安排

2.3.4重复性考察：称样6份，每份约50mg，用60%甘油液和水合氯醛试液，19∶1混悬，定容于10mL容量瓶中，每份制片10张，记录并计算显微特征常数,均数1490.5个/mg，RSD1.47%，重复性好。

2.3.5样品显微特征常数均数的确定和不同产地样品均数之间的比较:取神木产甘草、甘肃产甘草和陇西产甘草，约50mg，各5份，以确定方法制片10张，置显微镜下观察，记录显微特征个数，计算样品显微特征常数均数，分析不同产地样品均数之间的关系，数据见表3，用SPSS17软件进行成对资料统计分析，神木样与甘肃样之间显微特征均数有显著性差异，置信系数为0.01；神木样与陇西样之间显微特征的均数也有显著差异，置信系数为0.01。

表3　不同产地样品显微特征常数的实验数据

2.3.6实验结果:血球计数板用于药材显微定量是可行的，具体方法：取过100目筛样品适量，加入水合氯醛试液1份，然后加入60%甘油19份，混悬定容于10mL容量瓶中，用确定过液滴大小的滴管，吸取一滴，滴于已盖有盖玻片的血球计数板上，充满样品池，制片10张，置显微镜下观察，记录四个大方格内的显微特征个数，计算即可。从重复性实验数据的变异系数看：实验可重复性强。血球计数板样品池高度一定，样品池计数面积一定，故可提高样品的观察精度。

3　讨　论

实验用神木甘草，经鉴定为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根，甘肃甘草和陇西甘草原植物来源不详。不同产地样品显微特征常数的均数差异，是由于植物种间差异引起，还是由于产地差异引起，没有定论，可以肯定的是，神木甘草与甘肃或陇西甘草不同。实验中将甘草的“晶纤维”作为计数显微特征，是因为晶纤维不仅特征性强、有代表性、易于观察，而且在混悬液中稳定，如在不同处方中选山药淀粉粒或针晶、茯苓中选用菌丝一样[3-4]。从本研究看，显微特征常数是一个区间，这个区间受物种、生长年限和产地影响，但在一定范围之内，具体情况将在后续研究报道中给予详述。本研究与以往研究不同的是，在显微观察时采用了血球计数板，制样时直接混悬，提高了实验精度。该研究的意义在于可用于中药制药和食品调料的投料监控，也可用于粉末药材的纯度(掺伪)检测。

[1]陈聪慧，康廷国.金银花显微特征常数与化学成分相关性研究[J].中药材，2011,34(9)：1373-1376.

[2]刘歆韵，康廷国.逍遥丸中白芍、茯苓的显微定量研究[J].辽宁中医药大学硕士学位论文，2010.

[3]吴楠，康廷国.杞菊地黄丸中菊花、八珍益母丸中益母草显微定量研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2011.

[4]杨静，万峰峰，蔡慧侠,等.血复生胶囊质量控制[J].陕西中医，2013,34(2)：234-236.

(收稿2015-05-03；修回2015-06-01)

A study of micro-quantitative methods for crystal fiber in herbs from glycyrrhiza uralensis

Shaanxi Institution of Traditional Chinese Medicine(Xi’an 710077)

Yang ZhifengGao YujuanLi Jingmei

Objective:Improve the micro-quantitative methods for crystal fiber in herbs fromglycyrrhiza uralensis . Methods: Based on existing micro-quantitative methods, they replace “Shuifei” sample-making method (the process of which solid powder and liquid are grinded together in order to make suspension or remove contaminants) with Suspending sample-making method, and substitute blood-counting plates for common microscope slides. Besides，we determine sample quantity by linear analysis and optimize the proportion of suspension which is used for plates making as well as the number of sample plates for micro-quantity with orthogonal experiment method. Through inspecting the suspension stability，they could confirm the precise time period of the experiment. Results: The sample fineness should be 100 mesh. We need 10 slides to determine the sample quantity. Suspension: The mix of 60% glycerol and choral hydrate in the ratio of 19∶1. The average number of micro-characteristics of 1mg glycyrrhiza uralensis come from Shenmu is (1498±22)/mg. Conclusion: It is a practical way to use blood-counting plates to increase the ease of operation and accuracy of micro-quantitative method.

Glycyrrhiza uralensis@Crystalline fiber@ Quantitative

R286

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.079

*陕西省科技攻关项目(2012K19-03-08)

△西安医学院第一附属医院(西安 710077)

主题词 甘草@晶纤维@定量