色质联用技术在N-亚硝胺类物质分析中的应用

梁旭锋 黄杰 李宗芮 张雪琰 孙志广

（山东出入境检验检疫局 山东青岛 266002）

色质联用技术在N-亚硝胺类物质分析中的应用

梁旭锋 黄杰 李宗芮 张雪琰 孙志广

（山东出入境检验检疫局 山东青岛 266002）

介绍了N-亚硝胺类物质的分析技术现状，并按照不同基质，对近年来色质联用（主要是液相色谱-质谱和气相色谱-质谱）技术在N-亚硝胺类物质分析中的应用进行综述。

色谱-质谱联用技术；N-亚硝胺；应用；综述

1 前言

N-亚硝胺（N-Nitrosamines）是含有-N-N=O官能团物质的总称，它们的化学通式为：R1（R2）=NN=O。当R1=R2=烷基时，称为亚硝胺；当R1（或R2）=酰基时，称为亚硝酰胺。在人类接触的很多生活用品中，如橡胶制品、乳胶制品、食物、化妆品等，都能发现N-亚硝胺及其前体。N-亚硝胺的强致癌作用早已被确认，自20世纪50年代，国内外便开始研究N-亚硝胺类物质的危害性，研究表明N-亚硝胺不仅可以通过呼吸道、消化道进入人体，也可以通过皮肤的吸收进入体内诱发癌症，还能通过遗传导致后代畸变。为了去除这些环境污染物，就需要研究建立针对不同基质中N-亚硝胺类物质的检测技术。本文主要介绍了N-亚硝胺类物质在不同基质中的来源及检测方法。

2 N-亚硝胺物质分析技术现状

近年来，国内外报到了大量用于N-亚硝胺类物质检测的技术，如热能分析仪（TEA）、氮磷检测器（NPD）、氢火焰离子化检测器（FID）、电子捕获检测器（ECD）、气相色谱-质谱联用法（GC/MS）和液相色谱-质谱联用法（LC/MS）等。由于痕量挥发性N-亚硝胺的测定是一项困难而又耗时的工作，目前常规的检测手段难以全面鉴别各种N-亚硝胺，因此建立和完善N-亚硝胺类物质的检测方法已成为分析界的热点之一。

色谱-质谱联用技术是将色谱的高分离能力和质谱的定性功能相结合，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，它充分体现了色谱和质谱的优势互补。随着仪器的发展，色质联用技术在分析测试领域中发挥着越来越重要的作用，气相色谱-质谱联用（GC-MS），液相色谱-质谱联用（LC-MS）逐渐成为应用最多的检测手段。GC-MS具有操作条件稳定、使用方法成熟、分析速度快、检测灵敏度高的特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混合物未知组分的定性和定量分析，适用于小分子、易挥发和热稳定的化合物分析。LC-MS融合了LC的高分离能力和MS的高灵敏度、极强的定性专属性，几乎能检测所有的化合物，包括强极性、低挥发度、高分子量或热不稳定性的化合物，且大大缩短了分析时间，提高了分析的灵敏度和准确性，实现了定性分析和定量检测的完美结合，能广泛应用于N-亚硝胺类物质的分析。目前国内外针对N-亚硝胺类物质的研究主要有如下几类。

表1　已确定检出的N-亚硝胺类物质

3 色质联用技术在N-亚硝胺类物质分析中的应用

目前，色质联用技术在市场常规检测及实验室研究领域的运用越来越广泛和重要，它既发挥了现代色谱对复杂样品的高分离能力，又应用了质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够准确提供化合物分子质量与结构信息的优点［1］。

3.1橡胶制品分析

橡胶制品，尤其是与人体直接接触的家用橡胶制品，对健康的影响已成为人们关注的焦点，对其可能产生的有毒有害物质，特别是致癌性很强的N-亚硝胺的研究、检测以及相应标准的制定非常重要。橡胶制品中的N-亚硝胺主要来自以仲胺（如吗啉、二异丙胺等）为基础的硫化促进剂和硫磺给予体，这些物质与空气或配合剂中的氮氧化物（NOX）反应生成稳定的N-亚硝胺［2］；大部分橡胶制品中检出的N-亚硝胺主要来自添加或回收使用含有N-亚硝胺的橡胶原料。

日本学者Motoh Mutsuga等［3］对橡胶奶嘴及安慰品中的NDMA、NDEA、NDiPA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR、NEPhA、NMPhA、NDBzA、NDi-NA等多种N-亚硝胺迁移量进行了检测分析，建立的GC-MS方法操作简单、耗时短、灵敏度高，满足现行法规要求，可实现橡胶制品中N-亚硝胺类化合物的定性和定量，方法的检出限为1.0-1.5 μg/kg，用该方法对橡胶样品进行测试，检出NDMA、NDEA、NPIP、NMOR、NEPhA共5种N-亚硝胺，检出量在2.1-15 μg/kg之间，NDBA、NDBzA及不溶于水和人工模拟液的N-亚硝胺没有检出。国家标准方法［4］采用GC-MS测定橡胶及弹性体材料中的NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NMPhA、NMOR、NDPA、NPIP、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA共12种N-亚硝胺含量，样品于甲醇中超声提取，经旋转、蒸发浓缩后过C18固相萃取小柱，加入甲醇洗脱，方法的检出限为0.5 mg/kg。

陈婷等［5］建立了橡胶制品中NDMA、NMOR、NPYR、NMEA、NPIP、NDIP、NMPhA、NDPA、NEPhA、NDBA、NDEA、NDPhA、NDBzA共13种N-亚硝胺的LC-MS/MS测定方法，样品在密闭萃取瓶中于60℃下用甲醇超声萃取30 min，C18固相萃取小柱对萃取液进行净化，经C18色谱柱分离，最后用电喷雾正离子（ESI+）和多重反应监测模式（MRM）对13种N-亚硝胺进行定性、定量测定。各组分的相对标准偏差（RSD，n=7）小于10%，在实际样品中的加标回收率为70.7%-117.0%，方法的检出限（LOD）为0.5-500 μg/kg。该方法的样品前处理简单，后续分离、测定时间短，适于橡胶制品中多种N-亚硝胺的同时测定。通过对橡胶鞋（鞋底）、抗震垫、奶嘴等样品进行测定，结果表明，虽然样品中所含N-亚硝胺的化学组分有差异，但所有测试样品中均检出N-亚硝胺，且含量均高于欧盟或我国对橡胶、弹性体材料中N-亚硝胺的限量。

3.2乳胶制品分析

乳胶由于其优良的物理性能，已广泛应用于医疗及工业领域，是世界上广泛使用的原材料之一。1980年，Preussmann发现婴儿奶嘴含有挥发性的N-亚硝胺，可迁移到唾液中。近年来随着仪器发展和分析方法的改进，医用手套、避孕套等乳胶制品中也检测到N-亚硝胺。欧盟2012/160/EU号决议要求，供6个月以下儿童使用或可放入口内的玩具，其亚硝胺及亚硝基物质迁移限制分别＜0.05 mg/kg及≤1 mg/kg。

GC-MS是乳胶制品中N-亚硝胺物质监测的主要手段。鲜启明等［6］使用GC-MS法检测了市场常见的奶嘴、医用手套、避孕套等乳胶制品中NDEA、NDPA、NPIP、NDBA、NDPhA共5种N-亚硝胺析出物，样品经二氯甲烷萃取，用Rtx-5MS石英毛细管柱分离，采用十二烷作为内标进行检测计算，NDEA、NDPA、NPIP、NDBA的方法检出限分别为2.0、5.0、10.0、1.0、112.0 μg/L，试验样品中NDPA、NPIP、NDBA、NDPhA都有检出。

李丕等［7］建立了同时测定乳胶儿童用品中NDMA、NMEA、NDEA、NDiPA、NMPhA、NMOR、NDPA、NPIP、NEPhA、NDiBA、NDBA、NDPhA、NDCHA、NDBzA、NdiNA共15种N-亚硝胺及其前体物迁移量的SPE-GC-MS/MS分析方法。以人工唾液作为迁移模拟物，以Chromabond Easy固相萃取柱对迁移液中的N-亚硝胺分析物进行净化，采用HP-5MS UI色谱柱分离，MS/MS在多反应监测模式下进行定性及定量分析，方法的灵敏度满足相关产品法规的要求。在低、中、高3个添加水平的回收率为53.8%-116.2%、52.7%-105.1%和49.5%-102.9%。对10件奶嘴实际样品分析中，有4件检出N-亚硝胺，其中3件含量超过0.05 mg/kg；分析的7件气球样品均检出N-亚硝胺，且含量远超过0.05 mg/kg的限量要求。

3.3水质分析

在给水处理和污水处理中，氯化消毒是传统的有效方法，但消毒过程中，卤素元素（主要是氯）会和水中一些天然有机物反应生成一些有害环境和人体的物质。NDMA就是水处理领域新发现的一种氯化消毒副产物，是一种极具代表性的N-亚硝胺类物质［8］。作为一种低浓度高致癌风险的消毒副产物，近年来这类化合物在水环境中的高检出率引起人们的广泛重视。

水中低浓度的N-亚硝胺检测是目前环境分析研究的热点和难点，目前大都使用GC-MS联用方法。台湾学者Ssu-Chieh Fu等［9］研究了NDMA、NDEA、NMEA、NDPA、NDBA共5种N-亚硝胺的GC-MS检测技术。样品采用微固相萃取技术，提取条件是以CarboxenTM 1003作为吸附剂，在50 mL水样中（pH=7.0）加入5%的氯化钠溶液，振荡提取20 min，用150 mL二氯甲烷洗脱收集N-亚硝胺。方法定量限＜0.9 ng/L，样品平均回收率为62%-109%。优化的方法应用于实际样品的筛查，对游泳池中的水样分析显示，NDMA的浓度最高，浓度达到100 ng/L。

日本学者Suchul Yoon等［10］建立了污水、最终排放废水等一系列污水中NDMA、NDEA、NMEA、NMOR、NDPA、NPYR、NPIP、NDBA共8种N-亚硝胺的GC-MS/MS检测方法。样品经过固相萃取和净化后能有效分离目标化合物，该法可避免前处理过程中N-亚硝胺的丢失，提高回收率。方法检出限为0.1-1.0 ng/L，定量限为0.4-3.3 ng/L，回收率为80%-131%。采用SPE前处理方法对二级污水进行测试，除了NMEA和NDPA外，其余6种N-亚硝胺都被检出，浓度为1-1057 ng/L。

UPLC-MS/MS可以检测饮用水和污水中NDMA等热不稳定的N-亚硝胺类化合物，弥补GC/ MS的不足。罗茜等［11］建立了UPLC-MS/MS快速测定饮用水中NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NMOR、NPYR、NPIP、NDBA、NDPhA共9种N-亚硝胺的新方法。以N-二甲基亚硝胺-d6为贮存和回收率内标，N-亚硝基二丙胺-d14为定量内标，采用直接进样方法对N-二甲基亚硝胺（NDMA）定性和定量检测限分别为0.1和1.0 ng/L，N-亚硝基二丙胺为2.5和10 ng/L，其他7种N-亚硝胺的定性和定量检测限均为0.5和2.0 ng/L，方法中N-亚硝胺的检测限低于美国环保局规定的水中的最大允许浓度。检测数据表明，在自来水厂处理后出厂水中，3种具有高致癌风险N-亚硝胺化合物中NDMA的浓度为3.5 ng/L，NMEA和NDEA均未检出。

3.4肉制品分析

亚硝酸盐和硝酸盐广泛应用于肉制品加工过程中，它们能赋予肉制品理想的颜色、纹理、脂质过氧化，特别是在预防肉毒梭菌毒素形成方面发挥作用。亚硝酸盐能够与胺和氨基酸反应生成N-亚硝胺，可诱发有机体突变，对神经和肾脏有害，是致癌、致突变、致畸物质。GC-MS和LC-MS均可用于肉制品中N-亚硝胺的分析。

台湾学者Man-Chun Huang等［12］建立了熏肉、火腿、猪肉香肠等肉制品中NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPA、NPIP、NDBA共7种N-亚硝胺的GC-MS检测方法，样品采用微波辅助萃取与微固相萃取相结合。取5 g均质的肉制样品放在30 mL浓度为0.025 mol/L的氢氧化钠溶液中，在100℃下微波萃取10 min；萃取液过100 mg的CarboxenTM固相萃取柱，洗脱液振荡30min，用200μL二氯甲烷溶液洗脱，取10 mL上样。方法定量限为0.03-0.36 ng/g。

叙利亚学者Mohammad Al-Kaseem等［13］建立了贝类罐头、盐腌肉、午餐肉、熏制肉等肉制品中NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPA、NPIP、NDBA

共7种挥发性N-亚硝胺的GC-MS检测方法，将样品放入高压灭菌锅中于121℃条件处理10 min，用二氯甲烷液液萃取。方法检出限为0.077-0.18 ppb，定量限为0.26-0.60 ppb，采用高压灭菌法为肉制品前处理分析研究提供重要的借鉴。Mohammad Al-Kaseem等［14］在快餐店中的肉类样品里检出上述7种N-亚硝胺的总含量在2.60-13.28 μg/kg之间。

丹麦学者S.S.Herrmann等［15］采用LC-（APCI/ESI）MS/MS测定意大利香肠、培根等肉制品中NHPRO、NSAR、NMDA、NPRO、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA、NMA、NDBA、NDBzA、NTCA、NMTCA共15种亚硝胺，方法回收率在50%-130%，8种挥发性N-亚硝胺和6种非挥发性N-亚硝胺的定量限为0.1-36.8 μg/kg。该方法具有较普遍的实用性，可以满足肉制品中N-亚硝胺物质分析，在对市场销售的亚硝胺盐腌制肉制品进行检测中发现NDMA、NPYR、NMA、NPRO、NTCA、NMTCA等N-亚硝胺，而在非亚硝胺盐腌制的肉制品中没有检出。

3.5化妆品分析

化妆品中的N-亚硝胺一部分来自原料，另一部分则是在制作和放置过程中由前体物质经亚硝化形成。皮肤接触含有N-亚硝胺的化妆品后，在尿液中能够检出该成分，说明化妆品中的N-亚硝胺可对人体健康构成潜在危害，因此严禁在化妆品中添加N-亚硝胺。

化妆品中N-亚硝胺物质的检测主要采用GCMS方法。马强等［16］建立了GC-MS/MS法检测膏霜、水剂、散粉、香波、唇膏等不同类型的化妆品样品中NDMA、NDEA、NDPA、NMOR、NPYR、NPIP、NDBA、NDPhA、NDCHA、NDBzA共10种N-亚硝胺类物质。不同样品经适宜的提取溶剂超声提取，用DB-624石英毛细管色谱柱分离，MRM模式检测。10种挥发性N-亚硝胺的方法定量限为2.5-10 mg/kg。

4 结束语

综上所述，色质联用技术在N-亚硝胺类物质分析中以GC/MS方法为主，LC/MS方法相对较少。前处理方法主要采用有机溶剂配合超声提取，净化方法以SPE为主，在检测中，多采用串联质谱方法。随着色谱分离技术和质谱检测能力的提高，色质联用技术在定量分析及未知物筛查等研究领域会有更广泛的应用。

［1］甘宾宾，汤艳荣，蒋世琼.高效液相色谱-质谱联用技术在食品安全中的应用及进展［J］.化工技术与开发，2009，12：33-37.

［2］Oury B，Limasset J C，Protois J C.Assessment of exposure to carcinogenic N-nitrosamines in the rubber industry［J］.International archives of occupational and environmental health，1997，70（4）：261-71.

［3］Motoh Mutsuga，Miku Yamaguchi，Yoko Kawamura.Analysis of N-Nitrosamine Migration from Rubber Teats and Soothers［J］. American Journal of Analytical Chemistry，2013，4（6）：277-285.

［4］GB/T 24153-2009橡胶及弹性体材料N-亚硝基胺的测定［S］.

［5］陈婷，温裕云，欧延，等.固相萃取净化及超高效液相色谱-串联质谱法测定橡胶制品中的13种N-亚硝胺［J］.色谱，2014，01：89-94.

［6］鲜启明，黄沛力.乳胶制品中N-亚硝胺析出物的GC-MS/SIM检测［J］.分析测试学报，2008，04：445-447.

［7］李丕，白桦，李海玉，等.固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定乳胶儿童用品中15种N-亚硝胺及其前体物的迁移量［J］.色谱，2014，01：81-88.

［8］梁闯，徐斌，夏圣骥，等.SPE/LC/MS/MS检测水中痕量二甲基亚硝胺［J］.中国给水排水，2009，14：82-85，92.

［9］Fu Ssu-Chieh，Tzing Shin-Hwa，Chen Hsin-Chang，et al.Dispersive micro-solid phase extraction combined with gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry for the determination of N-nitrosamines in swimming pool water samples.［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，402（6）：2209-2216.

［10］Yoon Suchul，Nakada Norihide，Tanaka Hiroaki.A new method for quantifying N-nitrosamines in wastewater samples by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry［J］.Talanta，2012，97：256-261.

［11］罗茜，王东红，王炳一，等.超高效液相色谱串联质谱快速测定饮用水中9种N-亚硝胺的新方法［J］.中国科学：化学，2011，01：82-90.

［12］Huang Man-Chun，Chen Hsin-Chang，Fu Ssu-Chieh，et al. Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assistedextractioncoupledwithdispersivemicro solid-phaseextractionandgaschromatography-Chemical ionisation mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2013，138（1）：227-233.

［13］Mohammad Al-Kaseem，Zaid Al-Assaf，Franswa Karabet.Rapid and Simple Extraction Method for Volatile N-Nitrosamines in Meat Products［J］.Pharmacology&；Pharmacy，2013，4：611-618.

［14］Mohammad Al-Kaseem，Zaid Al-Assaf，François Karabeet.Determination of Seven Volatile N-Nitrosamines in Fast Food［J］. Pharmacology&；Pharmacy，2014，5（2）：195.

［15］S S Herrmann，L Duedahl-Olesen，K Granby.Simultaneous determinationofvolatileandnon-volatilenitrosaminesin processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation［J］.Journal of Chromatography A，2014，1330：20-29.

［16］马强，席海为，王超，等.气相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的10种挥发性亚硝胺［J］.分析化学，2011，08：1201-1207.

Application of Chromatography-Mass Spectrometry Technique in N-nitrosamines Analysis

Liang Xufeng，Huang Jie，Li Zongrui，Zhang Xueyan，Sun Zhiguang
（Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong，266002）

This study introduces the current situation of N-nitrosamines analysis.According to the different substrates,the application of chromatography-mass spectrometry technique which mainly includes liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry in the N-nitrosamines analysis were reviewed in recent years.

Chromatography-Mass Spectrometry；N-Nitrosamines；Application；Review

O657.63

E-mail：liangxf_100@163.com

山东出入境检验检疫局科研计划项目（SK201312）

2015-02-04