柘树果实的抗乳腺癌活性部分的提取、分离及结构鉴定

曹春廷，孙丛龙，白卫滨，*，孙建霞，李国强，欧仕益，杨　勇*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；3.广东工业大学轻工化工 学院，广东 广州 510006）

柘树果实的抗乳腺癌活性部分的提取、分离及结构鉴定

曹春廷1，2，孙丛龙2，白卫滨2，*，孙建霞3，李国强2，欧仕益2，杨勇1，*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；3.广东工业大学轻工化工 学院，广东 广州 510006）

为了得到柘树果实中具有抗乳腺癌活性的化合物，以人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞MCF-7为细胞模型，通过噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法评价柘树果实石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、以及正丁醇浸膏粗提取物部位的功能，实验发现乙酸乙酯部位具有明显的抑制乳腺癌细胞的活性，其对乳腺癌细胞MDA-M B-231和MCF-7的IC50分别为：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL。采用Sephad ex LH-20柱层析和硅胶柱层析对乙酸乙酯部位进行分离，采用单晶X衍射对得到的化合物进行结构鉴定，得到2 种晶体主成分，分别为4'-O-甲基-吡喃异黄酮、吡喃异黄酮。采用MTT方法对获得的2 种单体进行抗乳腺癌活性研究，发现吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制率达到56.7%。结果表明，柘树果实乙酸乙酯部位含有抗乳腺癌成分，且分离得到2 种类异黄酮化合物，其中吡喃异黄酮体现出一定的抗乳腺癌活性。

柘树果实；分离提取；抗乳腺癌；结构鉴定

柘树（Cudrania tricuspidata）为桑科（Moraceae）柘属（Cudrania）植物，又名柘木、柘桑、刺桑、奴柘等，全世界存在约有6 种柘属植物，主要分布在亚洲和大洋洲。在我国，柘属植物资源非常丰富，存在5 个品种和2 个变种［1］，主要分布在我国华南、西南、华北（除内蒙古外）各 省。柘树具有很大的药用价值，前人已经从柘 树中分离纯化出多种化合物，如黄酮、异黄酮、氧杂蒽酮、生物碱、糖类等［1-4］，对其活性进行研究发现具有抗肿瘤［5］、抗氧化［6］、保护肝脏［7］、抗炎镇痛［8-9］、保护肝脏［10］和抗结核［11］等作用，而这些生物活性主要是柘树中黄酮类化合物的作用［12-14］。Choi等［15］研究证明了柘树中含有抗乳腺癌的化学成分，从柘树根部分离得到的吉利柘树素A对MCF-7乳腺癌细胞的增殖有抑制作用，IC50为20.0 μg/mL。但上述研究主要集中在柘树的干燥根、根皮树皮以及柘木，而对柘树果实的研究相对较少。研究表明，柘果也具有很多活性物质［16-19］，如山柰、芦丁、槲皮素等，但由于柘树树龄超过50 年属于国家一级保护树种，禁止砍伐，而柘果由于一年一结果，并且同柘树根、柘树茎皮以及柘树茎研究利用相比，对其功效成分分析及营养作用知之甚少，对其开发远远不够，因此急需开展对柘果的研究。

截止目前，尚未发现柘树果实中抗乳腺癌的化学成分研究报道。因此，本实验对柘树果实的抗乳腺癌化学成分开展研究，以期为其在抗乳腺癌方面的开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

实验所用原料柘树新鲜果实，采于山东省烟台市。

人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞 暨南大学医药中心；MCF-7细胞CCTCC、MDA-MB-231细胞CCTCC、1640培养基、马血清、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素 美国Gibco公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美国Amresco公司；水溶性VE（Trolox） 美国Sigma公司；其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

柱层析用硅胶（100～200、200～300 目）、GF254硅胶薄层预制板 青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20丙基葡聚糖凝胶 GE Healthcare（中国）有限公司；薄层制备板（10 cm×10 cm） 烟台化学工业研究所；RE-52旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司；酶标仪美国Thermo Fisher Scientifi c公司；超净工作台 苏州净化设备公司；二氧化碳培养箱 美国Thermo Forma有限责任公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；三用紫外分析仪 上海骥辉科学分析仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1柘树果实粗提物获得

称取新鲜柘树果实270 g，匀浆机打碎后，置于提取罐中，快速加入1 000 mL甲醇溶剂，常温下静置浸提，24 h后收集浸提液，按上述操作，重复多次，合并浸提液。将获得的全部浸提液，1 500 r/min离心4 h，去掉浸提液中的悬浮物，取上清，在60 ℃条件下进行旋转蒸发，得浸膏（约200 g）。将得到的总浸膏用适量水混悬于烧杯中，依次在浸提罐中用纯石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，在80 ℃条件下进行旋转蒸发，得石油醚（petroleum ether，PE）浸膏31 g，乙酸乙酯（ethyl acetate，AE）浸膏120 g，以及正丁醇（n-butyl alcohol，n-BuOH）浸膏26 g。

1.3.2柘树果实抗乳腺癌有效部位确定

称取相同量获得的PE、AE，以及n-BuOH溶于二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制为母液，进行MTT实验［20］，评价三者的抑癌活性。其具体实验步骤为：收集生长对数期的细胞，通过计数来调整细胞悬液浓度，然后在96 孔板上铺板，每孔加入100 μL，使待测细胞调密度4 000/孔，且96 孔板的边缘孔用无菌磷酸缓冲盐溶液填充；含体积分数5%的CO2，37 ℃孵育，至细胞开始在孔底贴壁生长（96 孔平底板），加入质量浓 度梯度（0、10、20、40、80 μg/mL）的粗提物，原则上细胞贴壁后即可加药；用移液枪吸掉培养基，再加入含药培养基。每个质量浓度设置5 个复孔，同时设置空白组（加入培养基、MTT、DMSO）和对照组（加入细胞、培养液、MTT、DMSO，不加药物）。含体积分数5%的CO2，37 ℃孵育24 h；每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后，小心吸去孔内混合溶液，终止培养；然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，在酶联免疫检测仪上振摇5 min，使生成的甲瓒充分溶解，然后在波长490 nm处测量每个孔的光密度（OD）值。按下式计算生长抑制率。

式中：OD0为空白组的光密度值；OD1为对照组的光密度值；OD为实验组的光密度值。

1.3.3柘树果实有效成分分离、结构鉴定

活性部位经硅胶柱层析。称量200～300 目硅胶，30 倍于上样量，采用干法上样法，选用石油醚-乙酸乙酯容积系统，按照比例（100∶3～0∶100）进行梯度洗脱，每50 mL收集一个馏分。在浓硫酸香草醛作为显色剂条件下，用薄层层析分析合并馏分，再用Sephadex LH-20柱色谱进行分离纯化，用的凝胶柱为25 mm×1 200 mm大小，流动相为氯仿和甲醇，其体积比为1∶1，其余步骤与硅胶柱层析方法一致。分离得到晶体化合物采用单晶衍射进行结构鉴定。

1.3.4类异黄酮物质对乳腺癌细胞的抑制作用

两种类异黄酮化合物用DMSO溶解，母液浓度为50 mmol/L。MTT实验步骤及结果处理同1.3.2节。

2　结果与分析

2.1柘树果实对乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制效果

图1　3 种粗提物对MDA-MB-231细胞生长抑制率比较Fig.1　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MDA-MB-231 cells

如图1所示，与PE和n-BuOH部位相比较，AE部位抑制效果更明显，IC50为75.4 μg/mL，与空白组比较，有显著性差异（P＜0.05），表明柘树果实AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。

2.2柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果

图2　3 种粗提物对MCF-7细胞增殖抑制率比较Fig.2　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MCF-7 cells

如图2所示，与PE和n-BuOH部位相比较，AE部位表现出了明显的抑癌活性，IC50为66.8 μg/mL，与空白组比较，有显著性差异（P＜0.05），表明柘树果实AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。与乳腺癌细胞MDA-MB-231相比，柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7作用更强。

2.3柘树果实分离纯化化合物晶体结构

硅胶柱层析结束，选择浓硫酸香草醛作为显色剂，经薄层层析分析合并，得到多个总馏分。再将总馏分经过Sephadex LH-20柱层析纯化，运用单晶衍射的方法，对得到量大的2 个晶体化合物：4'-O-甲基-吡喃异黄酮（45 mg）、吡喃异黄酮（35 mg）并进行结构鉴定。

化合物4'-O-甲基-吡喃异黄酮：淡黄色针晶，化合物吡喃异黄酮：黄色方晶。2 个晶体的化学结构见图3，数据见表1。

图3　4 3 4'-O-甲基-吡喃异黄酮（a）和吡喃异黄酮（b）的化学结构Fig.3　Chemical structures of 4'-O-methylalpinumfisoflavone （a） and alpinumisoflavone （b）

表 1 4'-O-甲基-吡喃异黄酮和吡喃异黄酮晶体数据Table1　Crystal structural data of 4 -methylalpinumfisoflavone and alpinumisoflavone

2.4类异黄酮物质对乳腺癌细胞的抑制作用

图1、2表明，柘树果实对乳腺癌细胞MCF-7抑制作用更明显，因此选择MCF-7细胞作为研究对象，进一步研究获得的两种类异黄酮晶体4'-O-甲基-吡喃异黄酮和吡喃异黄酮对乳腺癌细胞的生长起抑制作用。MTT实验所用的类异黄酮物质的剂量为0、10、20、40、80 μmol/L，结果如表2。在80 μmol/L浓度作用下，4'-O-甲基-吡喃异黄酮和吡喃异黄酮两种类异黄酮物质对MCF-7细胞生长抑制率分别为12.9%和56.7%，吡喃异黄酮表现出一定的抗乳腺癌活性。

表 2 4'-O-甲基-吡喃异黄酮对MCF-7细胞生长抑制率Table2　Inhibitory rates of 4' -methylalpinumisoflavone against the growth of MCF-7 cells

3　讨 论

本实验对柘果在乳腺癌方面作用进行探讨，发现柘树果实具有抗乳腺癌作用，对不同株系的乳腺癌细胞作用效果不同，其MDA-MB-231和MCF-7的IC50分别为：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL，且乙酸乙酯部位是最有效部位。并进一步分离纯化得到2 种类 异黄酮类晶体化合物吡喃异黄酮和4'-O-甲基-吡喃异黄酮。研究吡喃异黄酮和4'-O-甲基-吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，发现吡喃异黄酮对乳腺癌细胞MCF-7具有一定的抗乳腺癌活性。有研究发现吡喃异黄酮和4'-O-甲基- 吡喃异黄酮具有氧化酶抑制活性，Han Xianghua等［16］研究发现柘果中的4'-O-甲基-吡喃异黄酮、吡喃异黄酮对鼠大脑单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）抑制作用，对MAO的IC50值分别为23.9 μmol/L和25.8 μmol/L。证明本实验分离出的两种类异黄酮物质具有一定的生物活性。

异黄酮类物质具有预防乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和骨质疏松等疾病［21］，有很强的生物效应。已有的很多科学研究表明异黄酮类化合物具有抗肿瘤的作用［22-24］。目前学术界公认的异黄酮抗肿瘤作用机制有：1）通过直接清除自由基或提高抗氧化物酶的活性来清除自由基，进而诱导肿瘤细胞凋亡；2）通过影响致癌物质的代谢酶的活性等来抑制肿瘤的发生；3）异黄酮类化合物能够显著地提高肿瘤细胞对某些化疗药物的敏感性［25］。

吡喃异黄酮和4'-O-甲基-吡喃异黄酮比传统异黄酮母核结构多一个联环，并且二者结构上只存在一个取代基的差异，但在抗乳腺癌活性研究中表现出不同的抑制效果，证明结构对功能的影响。下一步拟研究吡喃异黄酮和4'-O-甲基-吡喃异黄酮结构、生物活性及其作用机制，进一步为柘树果实营养功能的开发提供科学依据。

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Extraction， Separation and Structure Identification of Anti-breast Cancer Compounds from Cudrania tricuspidata Fruits

CAO Chunting1，2， SUN Conglong2， BAI Weibin2，*， SUN Jianxia3， LI Guoqiang2， OU Shiyi2， YANG Yong1，*
（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. Department of Food Science and Engineering， Jinan University， Guangzhou 510632， China；3. Faculty of Chemical Engineering and Light Ind ustry， Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006， China）

The purpose of the present work was to obtain anti-breast cancer compounds from Cudrania tricuspidata fruits. The methanol extract of Cudrania tricuspidata fruits was sequentially extracted with petroleum ether （PE）， ethyl acetate （AE） and n-butyl alcohol （n-BuOH） to obtain PE， AE and n-BuOH fractions. MTT assay was used to evaluate the anti-breast cancer activity of the methanol extract and its three fractions against breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7. The results showed that the AE fraction had significant inhibitory activity on MDA-MB-231 and MCF-7 cells with half maximal inhibitory concentrations （IC50） of 75.4 and 66.8 μg/mL， respectively. Then， the AE fraction was further separated by silica gel column chromatography a nd Sephadex LH-20 column chromatography assay. The structures of crystals obtained from this separation process were identifi ed using single-crystal X diffraction. Two major crystal components were identifi ed including 4'-O-methylalpinumisofl avone and alpinumisofl avone. As evaluated by MTT assay， the inhibitory rate of alpinumisofl avone against MCF-7 cell growth was 56.7%. Therefore， t he AE fraction from Cudrania tricuspidata fru its containing isofl avones and alpinumisofl avones has pot ent anti-breast cancer activity depending on the presence of alpinumisofl avone.

Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur. fruits； separation and extraction； anti-breast cancer； structural identifi cation

R151

A

1002-6630（2015）13-048-04

10.7506/spkx1002-6630-201513010

2014-12-27

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD36B04）

曹春廷（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养。E-mail：caochunting1@163.com

白卫滨（1978—），男，副研究员，博士，研究方向为食品营养与毒理安全性评价。E-mail：baiweibin@163.com杨勇（1969—），男，教授，博士，研究方向为肉品科学与技术。E-mail：yangyong676@163.com