功能食品中违禁磷酸二酯酶5抑制剂类和减肥类西药的检测

丁博陈文锐韦晓群曾广丰王志元*

功能食品中违禁磷酸二酯酶5抑制剂类和减肥类西药的检测

丁博1，2陈文锐1，2韦晓群1，2曾广丰1，2王志元1，2*

（1.广东出入境检验检疫局 广东广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室）

采用QuEChERS前处理技术提取、纯化功能保健食品中西地那非等磷酸二酯酶5（PDE-5）抑制剂类和酚酞等减肥类违禁西药化合物；TOF-MS高分辨质谱鉴定化合物准确分子量，定性分析86种PDE-5抑制剂类和66种减肥类药物，LC-Q-TOF-MS定量分析19种PDE-5抑制剂类和减肥类药物。14种PDE-5抑制剂类药物检出限为1.2-3 μg/L，线性范围10-400 μg/L；5种减肥类药物检出限为0.01-0.3 μg/L，线性范围1-200 μg/L。结果表明，该分析方法快速、灵敏、准确鉴定与测定功能保健食品中PDE-5抑制剂类和减肥类违禁药物。

QuEChERS前处理技术；LC-Q-TOF-MS；磷酸二酯酶5抑制剂类；减肥类

1 前言

随着经济社会的发展，人们越来越重视饮食营养和自身健康，其中在食物营养方面，除了关注食物基本营养与能量补充，也更加注重食物中具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血压、降血脂、抗疲劳、减肥等保健作用的功效成分［1-6］，尤其是抗疲劳和减肥类功能食品备受广大消费者的亲睐。然而不法厂商经常向此类功能食品中添加西药成分，宣称其产品具有某中保健功能作用，严重影响了人们群众的身心健康。近年来，科研工作者检测发现保健食品中存在大量添加磷酸二酯酶5（PDE-5）抑制剂类和减肥类违禁西药。韩国学者Kim等［7］利用LC-HR/MS测定日常膳食中9种PDE-5抑制剂类违禁药物，发现这些功能食品中含有西地那非和他达那非等物质。新加坡和中国学者［8］综述西地那非PDE-5抑制剂类药物分析检测方法，其检测技术有HPLC、GC-MS、LC-MS、NMR、LC-FI-ICR-MS、UPLC-TOF-MS、IMS和酶联免疫法等，并发现市场上流通各类男性保健食品中含有50多种以上的西地那非类似物。加拿大学者Philippe［9］等利用LC-MS快速分析71种西地那非、他达那非等PDE-5抑制剂类药物，研究这些物质在功能食品等产品中掺杂伪劣情况。Hyung Joo等［10］利用LC-MS/MS方法分析食品和膳食补充剂中29种减肥类药物的含量，研究分析了188种样品，发现减肥功能食品中掺杂双醋苯啶、麻黄素、氟西汀、伪麻黄碱、番泻苷A和B等违禁药物。李丹等［11］利用LC-MS/MS方法快速筛选分析保健食品中非法添加酚酞、布美他尼等11种减肥类药物。

QuEChERS最早由Kolberg等［12］报道用来检测农药残留分析的前处理技术分析方法，作为一种种高效前处理方法应用在食品农药残留检测分析领域。近年来文献报道QuEChERS技术还被用来提取分离大豆中异黄酮类化合物［13，14］，可见QuEChERS技术是一种非选择性的目标物前处理分析方法。本研究采用QuEChERS与LC-Q-TOF-MS联用技术分析功能食品中PDE-5抑制剂类和减肥类违禁西药，建立PDE-5抑制剂类和减肥类西药TOF-MS高分辨质谱定性分析方法，以及LC-Q-TOF-MS定量分析方法。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验样品

市场上采购男性补酒、抗疲劳保健品和女性减肥保健品。

2.1.2仪器

Triple TOF®5600+高分辨质谱仪：美国ABsciex公司；HPLC 20AD高效液相色谱仪：日本岛津公司；Atlantis®T3色谱柱（100 mm×3 mm，3 μm）：美国Waters公司；氮吹浓缩仪（Turbo Vap@LV）：瑞典Biotage公司；T25高速均质机：德国IKA公司；4k-15离心机：美国Sigma公司；VORTEX 4旋涡混匀器：德国IKA公司；Milli-Q超纯水装置：美国Millipore公司。

2.1.3试剂

盐酸伐地那非、他达那非、伪伐地那非、硫代艾地那非、羟基红地那非、氨基他达那非、Gendenafil、硫代西地那非、红地那非、豪莫西地那非、西地那非、羟基豪莫西地那非、Rac xanthoabthrafil、硫代豪莫西地那非（14种PDE-5抑制剂类药物），酚酞、氟西汀、布美他尼、安非他酮、西布曲明（5种减肥类药物）等标准品：纯度大于98%，德国Dr Ehrestorfer公司提供；甲醇、乙腈、甲酸：色谱纯，美国Fisher公司；无水硫酸镁、氯化钠：分析纯，广州化学试剂厂；GCB分散剂：美国sigma公司；微孔滤膜：0.22 μm，津腾公司；微纤维滤纸：美国Vicam公司；实验用水：经Milli-Q纯水系统制得的超纯水（电阻率为18.2 MΩ）。

2.2方法

2.2.1溶液配制

（1）标准储备液

准确称量19种PDE-5抑制剂类和减肥类药物标准品（每种标准品10.00 mg），用甲醇溶解配制浓度为1 mg/mL的标准储备液，根据需要稀释成质量浓度为20 μg/mL的混合标准工作液，于棕色瓶中4℃保存，有效期3个月。

（2）标准溶液

用甲醇稀释20 μg/mL混合标准工作液，配制成浓度分别为1、5、10、25、50、100、200、400 μg/L混合标准溶液待LC-Q-TOF-MS测定。

2.2.2液相条件

色谱柱：Atlantis®T3色谱柱（100 mm×3 mm，3 μm）；进样体积：5 μL；流速：0.5 mL/min；柱温：40℃；梯度洗脱：流动相A-0.1%甲酸水溶液，流动相B-乙腈；PDE-5抑制剂类药物梯度洗脱方法：初始10%B相，1 min升至30%，7 min升至60%，1 min降至10%，保留5 min；减肥类药物梯度洗脱方法：初始10%B相，5 min升至70%，1 min升至100%，保留2 min，0.2 min降至10%，保留2 min。

2.2.3质谱条件

离子源：ESI和APCI复合源；扫描方式：正离子；APCI源：连接ABsciex公司自动校正系统（CDS），每10个样品自动校正1次；APCI正离子校正液流速：0.3 mL/min；Curtain gas：40 psi；离子源gas 1：50 psi；离子源gas 2：50 psi；离子源温度：500℃；离子源电压：5500 V；一级TOF-MS扫描准确质量范围：100-1000 Da；数据采集时间：100 ms；DP：100V；CE：10V；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50-1000 Da；DP：100V；CE：35±15V；高灵敏模式；数据采集时间：50 ms；信号阈值：100 cps；IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

2.2.4数据分析方法

所有质谱数据由ABSciex公司的Analyst TF 1.6软件采集，数据在PeakView 2.0、MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等软件上定性定量处理分析。整理文献报道西地那非等PDE-5抑制剂类化合物以及酚酞等减肥类化合物，得到86种PDE-5抑制剂类和66种减肥类药物的MasterView数据；根据TOF-MS高分辨质谱获得化合物的准确分子量，定性分析功能食品中添加违禁PDE-5抑制剂类和减肥类西药成分。

2.2.5样品处理

液体样品准确量取1 mL，甲醇稀释定容到10 mL容量瓶；固体样品粉碎研磨准确称量1.000 g，甲醇溶解定容到10mL容量瓶。取1mL样品溶液，依次加入10 mL的乙腈水溶液（乙腈∶水=90∶10，70∶30，50∶50），1 g无水硫酸镁、0.25 g氯化钠，涡旋1min，超声10 min，8000 r/min离心5 min，移取上清液，加入7 mL乙腈，涡旋、超声、离心，移取上清液合并定容到25 mL刻度试管中，待LC-Q-TOF-MS测试。

3 结果与讨论

3.1数据分析结果

86种PDE-5抑制剂类和66种减肥类药物的MasterView数据见表1和表2。

表1　86种PDE-5抑制剂类MasterView数据

（续表1）

表2　66种减肥类MasterView数据

（续表2）

3.2PDE-5抑制剂类药物QuEChERS与LC-QTOF-MS方法选择

3.2.114种PDE-5抑制剂类药物的质谱图

用ABSciex triple TOF 5600+高分辨质谱仪获得每种PDE-5抑制剂类药物的一级TOF-MS和二级IDA-MS质谱数据。准确分子量、同位素分子量和准确碎片分子量等质谱数据用来定性分析；根据一级TOF-MS准确分子量对应离子流色谱信号强度定量分析。14种PDE-5抑制剂类化合物提取离子流色谱图见图1，高分辨质谱数据见表3。

图1　14种PDE-5抑制剂类药物离子流色谱图

表3　PDE-5抑制剂类药物高分辨质谱数据

由图1和表3可知14种PDE-5抑制剂类药物测定获得目标物的分子量、同位素及分子式的实验数值，与理论计算值进行比较分析，从而可建立灵敏、准确的PDE-5抑制剂类违禁药物的定性定量分析方法。

3.2.2仪器方法的检出限、定量限和线性范围

将14种PDE-5抑制剂类药物混合标准液按照色谱和质谱条件进行测定，固体样品和液体样品稀释250倍，得到每种物质LC-Q-TOF-MS仪器方法的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限，结果见表4。

表4　PDE-5抑制剂类药物的检出限、定量限与线性范围

3.2.3PDE-5抑制剂类QuEChERS优化

选择2种不同的男性补酒样品为基质，加入60 μg/LPDE-5抑制剂类药物混合标准溶液，以回收率为指标，分别考察乙腈与水比例（90∶10、70∶30和50∶50），无水硫酸镁和氯化钠用量（1 g MgSO4+ 0.25 g NaCl，2 g MgSO4+0.5 g NaCl），分散剂GCB使用情况，结果见表5。

表5　PDE-5抑制剂类QuEChERS优化数据结果

（续表5）

表5显示，当提取溶剂乙腈∶水=70∶30、分散剂无水硫酸镁与氯化钠用量为1 g与0.25 g时，PDE-5抑制剂类药物加标的回收率较佳。因此，试验选择乙腈∶水=70∶30溶液为提取溶剂，1 g无水硫酸镁和0.25 g氯化钠为分散剂。

3.3减肥类药物QuEChERS与LC-Q-TOF-MS方法选择

3.3.15种减肥类药物的质谱图

用ABSciex triple TOF 5600+高分辨质谱仪获得每种减肥类药物的一级TOF-MS和二级IDA-MS质谱数据。准确分子量、同位素分子量和准确碎片分子量等质谱数据用来定性分析；根据一级TOFMS准确分子量对应离子流色谱信号强度定量分析。5种减肥类化合物提取离子流色谱图见图2，高分辨质谱数据见表6。

图2　5种减肥类药物离子流色谱图

表6　减肥类药物高分辨质谱数据

由图2和表6可知5种减肥类药物测定获得目标物的分子量、同位素及分子式的实验数值，与理论计算值进行比较分析，从而可建立灵敏的准确的减肥类违禁药物的定性定量分析方法。

3.2.2仪器方法的检出限、定量限和线性范围

5种减肥类药物混合标准液按照色谱和质谱条件进行测定，减肥类样品稀释250倍，得到每种物质LC-Q-TOF-MS仪器方法的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限，结果见表7。

表7　减肥类药物的检出限、定量限与线性范围

3.3.3减肥类药物QuEChERS优化

选择2种不同减肥样品为基质，加入20 μg/L减肥类药物混合标准溶液，以回收率为指标，考察乙腈与水比例（90∶10、70∶30和50∶50），无水硫酸镁和氯化钠用量（1 g MgSO4+0.25g NaCl，2 g MgSO4+ 0.5 g NaCl），分散剂GCB使用情况，结果见表8。

表8　减肥类QuEChERS优化数据结果

表8显示，当提取溶剂乙腈∶水=50∶50时，减肥类药物加标的回收率较佳。因此，试验选择乙腈∶水=50∶50的溶液为减肥类药物QuEChERS的提取溶剂；另外，结果显示分散剂无水硫酸镁与氯化钠用量为1g与0.25g时，减肥类药物提取率较佳，由此选择1g无水硫酸镁和0.25g氯化钠为QuEChERS分散剂。3.4功能食品中PDE-5抑制剂类药物测定

3.4.1PDE-5抑制剂类药物IDA-MS定性分析

86种PDE-5抑制剂类药物IDA-MS的定性分析5个固体样品和5个男性补酒样品，发现固体样品1含有伐地那非和乙酰伐地那非，固体样品2中含有红地那非、二甲基西地那非和去甲基西地那非，固体样品3含有红地那非、二甲基西地那非和去甲基西地那非；补酒1中含有豪莫西地那非和艾地那非，补酒2中含有伐地那非那非、豪莫西地那非和西地那非，补酒3中含有氨基他达那非、补酒4中含有反式氨基他达那非，补酒5含有反式氨基他达那非。3.4.2LC-Q-TOF-MS定量分析PDE-5抑制剂类药物含量

10个样品进行定量检测，结果见表9。

表9　实际样品测定结果

表9结果显示，固体样品1中含有13.68 μg/g伐地那非，固体样品2中含有65.57 μg/g红地那非，固体样品3中含有61.55 μg/g红地那非；补酒1中含有13.68 μg/mL豪莫西地那非，补酒2中含有5.511 μg/mL伐地那非、5.060 μg/mL豪莫西地那非和3585 μg/mL西地那非。

3.5功能食品中减肥药物测定

66种IDA-MS减肥药物定性分析7个减肥样品，发现样品1中含有大黄素，样品2中含有麻黄碱，样品3中含有大黄素和咖啡因，样品4中含有咖啡因，样品6中含有咖啡因、苯佐卡因和茶碱，样品7中含有西替利司他。

4 结论

本研究建立QuEChERS前处理技术与LC-QTOF-MS分析方法检测功能食品中非法添加PDE-5抑制剂类和减肥类违禁药物，前处理方法简单、耗时少、效率高；IDA-MS高分辨质谱可以快速定性筛查分析保健食品中违禁添加PDE-5抑制剂类和减肥类药物；LC-Q-TOF-MS分析方法简便、快速、准确，适合保健食品中非法添加PDE-5抑制剂类和减肥类违禁药物的含量测定。

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Detection for PDE-5 Inhibitors and Weight Loss Drugs in Health Food

Ding Bo1，2，Chen Wenrui1，2，Wei Xiaoqun1，2，Zeng Guangfeng1，2，Wang Zhiyuan1，2*
（1.Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong，510623；2.Guangdong Province Key Laboratory of Technical Measures of Importing and Exporting Animal，Plant and Food）

It was studied that PDE-5 inhibitors and weight loss drugs in health food had been carried out.PDE-5inhibitorsandweightlossdrugswereextractionandpurifiedbyQuEChERS.With identification for 86 PDE-5 inhibitors and 66 weight loss drugs by high resolution TOF-MS，it was detected for 19 PDE-5 inhibitors and weight loss drugs by LC-Q-TOF-MS.The limits of detection about 14 PDE-5 inhibitors were 1.2-3 μg/L and linear range 10-400 μg/L；in contrast，5 weight loss drugs were 0.01-0.3 μg/L and linear range 1-200 μg/L.The result showed that this method was rapid，sensitive and accurate，which was suitable for detection and identification of PDE-5 inhibitors and weight loss drugs in health food.

QuEChERS；LC-Q-TOF-MS；PDE-5 Inhibitors；Weight Loss

O657.63

E-mail：dingbo@mail2.sysu.edu.cn；*通讯作者E-mail：wzyciq@163.com

广东出入境检验检疫局科技计划项目（GD2013K48），广州市科技计划项目（KHYZ2013B17）

2015-03-31