中华稻蝗总RNA的提取及鉴定

魏福伦　徐晓舒　黄敏

摘要：提取中华稻蝗（Oxya chinensis）的总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR、AChE片段的扩增等方法鉴定RNA的纯度和完整性。结果表明，从中华稻蝗头部提取的总RNA质量和完整性较好，能满足后续分子生物学的研究需要。

关键词：中华稻蝗（Oxya chinensis）；RNA；提取；鉴定

中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4862-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.054

Abstract： The total RNA from Oxya chinensis was extracted. The purity and integrity was detection by agarose gel electrophoresis， ultraviolet spectroscopy， reverse transcription polymerase chain reaction， and acetylcholin esterase fragment amplification. The results showed that quality and intergrity of extracted total RNA was good， and could statisfy need for follow-up molecular biology research.

Key words： Oxya chinensis； acetylcholin esterase； RNA； extraction； identification

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholin esterase，AChE）是生物神经传导中的一种关键酶，在神经传导中执行着重要的功能。该酶能降解乙酰胆碱，终止神经递质对于突触后膜的兴奋刺激作用，保证神经信号分子在生物体内的正常传导。AChE上存在有机磷与氨基甲酸酯类化合物的结合位点，当这两类化合物与AChE结合后，会造成酶催化部位的磷酰化与氨基甲酰化，使其对乙酰胆碱无法进行乙酰化作用，从而破坏了神经的正常传导作用，使乙酰胆碱与神经后膜的乙酰胆碱受体的作用无法终止，造成生物长期处于神经兴奋状态而最终导致死亡。为了研究乙酰胆碱酯酶的具体作用机制，将AChE应用于害虫的抗药性研究及检测环境中的有机磷与氨基甲酸酯类农药，证实昆虫AChE的突变会导致药物抗性的产生[1]。

中华稻蝗（Oxya chinensis）隶属于直翅目（Orthoptera）斑腿蝗科（Catantopidae）稻蝗属（Oxya），在我国除新疆、西藏等少数地区外，大多数水稻种植区均有分布，多栖息于稻田等湿度较大的地方，以禾本科农作物为食，是我国重要的农业害虫[2，3]，给农业生产带来了极大的危害。近年来，对中华稻蝗的研究工作主要集中在形态分类学[3]、细胞分类学[4]、生理与发育[5，6]、分子系统学[7]和农药毒理学[8]等方面，而从RNA的角度研究乙酰胆碱酯酶的表达尚未见相关报道。动物组织中总RNA的提取是分子生物学基本技术之一，高质量RNA是进行RT-PCR、cDNA文库构建、Northern blot等分子生物学研究的基础。在RNA提取过程中，由于RNase非常稳定，极易导致RNA降解，要获得纯度高、完整性好的高质量RNA有一定的难度。本研究提取了中华稻蝗的总RNA，再利用半定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术进行了鉴定，以期对后续的研究奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 试验用中华稻蝗的成虫，采自贵州省遵义市。

1.1.2 试剂 总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）购自生工生物工程（上海）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。试剂均用0.1%的DEPC水配制，塑料耗材用0.1%的DEPC水处理过夜后湿热高温灭菌，研钵等器皿在180 ℃烘烤6 h以上，以避免RNA酶的污染。RT-PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 取4只中华稻蝗成虫，分别取其头部、胸部、腹部，除翅膀外的全虫，分别提取其总RNA，按试剂盒说明书的方法提取。将提取的RNA稀释50倍后，用T8紫外可见分光光度计测定OD260 nm/OD280 nm的比值。再取5 μL RNA，加入6×上样缓冲液，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳完后观察结果并拍照。

1.2.2 cDNA的检测 按RT-PCR试剂盒的使用说明，将中华稻蝗的总RNA反转录成cDNA，作为PCR检测的模板。选用中华稻蝗持家基因actin基因进行PCR，以验证提取的RNA是否可用，使用的引物为P1： 5′-CACCAGGGTGTGATGGTCGG-3′，P2： 5′-CCACCGATCCAGACGGAGT-3′，目标片段大约为600 bp，PCR扩增体系（25 μL）：10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，模板DNA 1μL，ddH2O 17 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，59 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

1.2.3 AchE基因cDNA片段的扩增 在NCBI的GenBank的数据库中查找与中华稻蝗亲缘关系近的物种的乙酰胆碱酯酶cDNA序列，用Clustal X进行同源性比较，利用Primer premier 5.0设计出3对简并引物（表1）。将设计的3对引物分别用于PCR扩增，扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%的琼脂糖进行电泳，电泳完后观察结果并拍照。endprint

2 结果与分析

2.1 总RNA的质量与纯度

将中华稻蝗头部提取的总RNA样品稀释后，琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰，可见28S RNA、18S RNA两条带，且拖尾现象不明显，说明提取的RNA完整性较好，蛋白质污染较少（图1）。经紫外分光光度法检测RNA样品吸光度，OD260 nm/OD280 nm为1.9，表明提取的RNA样品中蛋白质等杂质含量较低。其余部位提取的总RNA样品质量及纯度较差。

2.2 cDNA的检测结果

对中华稻蝗头部所提取的总RNA进行PCR检测，目的条带清晰，与预期大小一致（约600 bp）（图2）。结果表明，从中华稻蝗头部所提取的RNA质量和完整性都较好，可以满足后续分子生物学试验的要求。

2.3 AChE基因cDNA片段扩增结果

由图3可以看出，用设计的3对引物扩增AChE基因片段，仅F3、R3扩增出一条1 000 bp以上的条带。

3 小结与讨论

昆虫中AChE主要分布在由脑、食道下神经节、腹神经索组成的中枢神经系统中。在总RNA提取时，取中华稻蝗成虫的头部、胸部、腹部和除翅膀外的全虫，分别提取其总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其质量和含量。经琼脂糖凝胶电泳检测，从中华稻蝗头部提取的总RNA无明显降解现象，总RNA质量、完整性良好。

对逆转录的cDNA进行检测时，本试验使用的内参基因是β-actin，目的条带清晰，位置正确（约600 bp），说明cDNA模板的质量较好。对逆转录的cDNA进行后续试验，即AChE片段扩增，其中F3、R3扩增出大于1 000 bp的片段，与预期结果一致。

综上所述，经过琼脂糖凝胶电泳，再进一步经过内参基因检测和AChE片段的扩增检验，证明从中华稻蝗头部提取的总RNA质量、完整性良好，可用于RT-PCR、cDNA文库构建、Northern blot等后续分子生物学试验。

参考文献：

[1] FOURNIER D，BRIDE J M，HOFFMANN F，et al.Acetylcholinesterase：Two types of modifications confer resistance to insecticide[J].Biol Chem，1992，267：14270-14274.

[2] 冯祥和，牛泽民.中华稻蝗在水稻上危害损失及防治指标研究的商榷[J].昆虫知识，1994，31（4）：198-200.

[3] 郑哲民.蝗虫分类学[M].西安：陕西师范大学出版社，1993.76-80.

[4] 马恩波，白贵荣，郭亚平，等.斑腿蝗科精小管形态及其分类学意义探讨[J].动物学报，2001，47（S）：30-35.

[5] 崔志新，林进添，赵善欢.印楝素对中华稻蝗若虫呼吸作用的影响[J].华中农业大学学报（自然科学版），2001，20（6）：544-546.

[6] 许升全，郑哲民.蝗总科昆虫雌雄下生殖板及系统发育关系研究（直翅目）[J].昆虫分类学报，1999，21（2）：79-83.

[7] 任竹梅，马恩波，郭亚平.山稻蝗及相关物种Cyt b基因序列及其遗传关系[J].遗传学报，2002，29（6）：507-513.

[8] 卢芙萍，李翠兰，段毅豪，等.马拉硫磷对中华稻蝗种群遗传结构的作用[J].遗传，2004，26（5）：663-668.endprint