超声与乙醇/硫酸铵双水相体系耦合提取甘草中总黄酮的研究

李志英，智新，张焱，董晶

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

超声与乙醇/硫酸铵双水相体系耦合提取甘草中总黄酮的研究

李志英，智新，张焱，董晶

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

以甘草为原料，利用超声与乙醇-硫酸铵双水相体系耦合提取甘草粉末中的总黄酮。通过进行单因素试验和正交试验得到甘草总黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明：利用超声与乙醇-硫酸铵双水相体系耦合对甘草总黄酮进行提取分离的最佳工艺条件为：料液比1∶35；醇水比0.7∶1；硫酸铵的质量浓度0.25 g/mL，提取时间40 min。在此条件下，甘草总黄酮得率是1.96%。与超声法比较，双水相体系耦合提取得率明显高于常规超声提取法。

超声提取；双水相体系；甘草；总黄酮；正交实验

甘草为豆科植物甘草、胀果甘草、光果甘草的根茎，是我国2000多种草药中用量最大的一味草药，素有“十方九草，无草不成方”之说，享有“中草药之王”的美誉［1］。它的干燥根茎具有消热解毒、祛痰止渴、润肺止咳的功效，主要含有三萜类成分及黄酮类化合物，后者具有显著的清除人体内自由基、治疗心血管疾病、抗心律失常、抗肿瘤，抗癌等功效［2］。国内外的研究表明，黄酮类化合物不仅具有多种生物学活性，而且具有剂量小、见效快、毒性低等优点，所以在食品和医药保健领域方面有着十分广阔的应用前景［3］。

双水相萃取法，是一种新型的液-液萃取技术，条件温和，萃取时间短，提取效率较高，操作简便，且几乎不存在有机溶剂残留问题，受到人们极大的关注，是一种很有发展前途的萃取方法［4］。随着研究的不断深入，以无机盐代替高聚物的普通有机物双水相体系，因其价格低廉、低毒、体系简单、溶剂的回收利用及后续处理容易等优点使双水相萃取的工业化成为可能［5］。此外，超声提取法利用超声波的“空穴作用”产生的冲击波和射流破坏植物细胞的结构式黄酮化合物释放和溶出，而将双水相技术与超声技术进行集成促进了不同分离技术的交叉、渗透和融合，有效提高了分离效率［6］。本文以一定浓度的乙醇溶液和硫酸铵组成的双水相体系与超声耦合来提取甘草中的总黄酮，并通过单因素实验与正交实验考察料液比、醇水比、硫酸铵的质量浓度和提取时间等提取条件对总黄酮得率的影响，从而选择出适合提取甘草总黄酮的最佳条件。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Fw135型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV-1800型紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵：南京临江科技开发有限责任公司。甘草：购于山西省忻州市五台山大药房，在100℃烘干3 h，固体粉碎机粉碎，过120目筛，装瓶备用；硝酸铝：天津市光复精细化工研究所；槲皮素：国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2溶液的配制

槲皮素标准溶液（0.125 mg/mL）：准确称取槲皮素0.025 0 g，用少量无水乙醇溶解后，转移至50 mL的容量瓶中，再用30%乙醇定容，得到浓度为0.5 mg/mL的槲皮素标准溶液。取25 mL该溶液，用30%乙醇定容至100 mL的容量瓶中，得到浓度为0.125 mg/mL的槲皮素标准溶液以备用。硝酸铝溶液（1%）：准确称取1.000 3 g硝酸铝固体，加入蒸馏水溶解后，将溶液转移至100 mL的容量瓶中定容。

1.3甘草总黄酮的提取方法

准确称取1.000 0 g甘草粉末于100 mL具塞锥形瓶中，按照1∶30的固液比、0.7∶1醇水比以及0.30 g/mL硫酸铵1 mL，在超声波功率为280 W、温度为50℃的条件下提取30 min，趁热对提取液进行减压抽滤，将滤液转移至分液漏斗中，静置分层后，将上层乙醇相溶液转移至100 mL的容量瓶中，并用30%乙醇定容［7］。

1.4甘草总黄酮的测定方法

准确量取提取液2 mL于10 mL比色管中，分别加入1%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，用30%乙醇溶液定容，以30%乙醇做空白对照，在波长269 nm处测定其吸光度，根据标准曲线回归方程，得到提取液浓度，总黄酮的得率按照下式计算：Et%=（C×V×50）/W× 100%，式中Et%为得率，C为测得的提取液浓度，W为原料的质量［8］。

2结果与讨论

2.1最大吸收波长

准确量取0.125 mg/mL的槲皮素标准溶液0.2 mL甘草黄酮提取液2 mL于两支10 mL比色管中，按实验1.4的方法，以30%乙醇做空白对照，在波长200 nm～600 nm之间扫描，结果如图1。

图1　最大吸收波长的测定Fig.1The determination of maximum absorption wavelength

图1中，曲线1和曲线2分别为槲皮素和甘草黄酮提取液的吸收光谱，二者均在269 nm处有最大吸收，故选择测定波长为269 nm。

2.2槲皮素标准曲线的绘制

精确量取0.125 mg/mL的槲皮素标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL的比色管中，加入1%硝酸铝溶液1 mL，用30%的乙醇定容至10 mL。以30%乙醇为空白对照，利用紫外分光光度计在波长269 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=42.4x+0.204 6，R2=0.999 7。式中：x为质量浓度，mg/mL；y为吸光度值。

2.3固液比对甘草总黄酮得率的影响

准确称取1.000 0 g甘草粉五份于具塞锥形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它条件，改变料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35进行提取，得提取液，精确吸取样品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法测定，结果如表1。

表1　料液比对甘草黄酮得率的影响Table 1Effect of material liquid ratio on yield of the licorice flavonoid

由表1可知，随着固液比的增大，甘草总黄酮的得率不断上升，当固液比为1∶30时，甘草总黄酮得率达到最大值，此后，随着乙醇用量以及硫酸铵溶液体积的增加，总黄酮的得率随之下降，因此固液比为1∶30时最合适。

2.4醇水比对甘草总黄酮得率的影响

准确称取1.000 0 g甘草粉五份于具塞锥形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它条件，改变醇水比分别为0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1进行提取，得提取液，精确吸取样品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法测定，结果如表2。

表2　醇水比对甘草黄酮得率的影响Table 2Effect of alcohol water ratio on yield of the licorice flavonoid

由表2可知，在醇水比为0.4∶1～0.7∶1的条件下，甘草总黄酮的得率得到了明显的提升，当醇水比达到0.7∶1时，黄酮得率最大，继续增加醇水比总黄酮得率反而下降，其主要原因是随着乙醇用量的增加，黄酮在乙醇中的溶解度也逐渐增大，再增加乙醇的体积，可能会影响双水相体系的分相能力，从而导致得率下降，因此0.7∶1为最佳醇水比。

2.5硫酸铵质量浓度对甘草总黄酮得率的影响

准确称取1.000 0 g甘草粉五份于具塞锥形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它条件，改变硫酸铵溶液浓度比分别为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 g/mL进行提取，得提取液，精确吸取样品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法测定，结果如表3。

表3　硫酸铵的质量对甘草黄酮得率的影响Table 3Effect of the quality of ammonium sulfate on yield of the licorice flavonoid

由表3可知，在固液比和醇水比一定的条件下，硫酸铵的质量浓度为0.30 g/mL时，甘草总黄酮得率可达到最大，此后，质量浓度继续增大，甘草总黄酮得率逐渐下降，这是因为硫酸铵用量刚开始增大时，它的盐析作用不断增强，双水相体系的分相能力也逐渐增大，溶解黄酮的乙醇相浓度也逐渐增大［9］；为了形成稳定的双水相体系，硫酸铵的最佳质量浓度为0.30 g/mL。

2.6提取时间对甘草总黄酮得率的影响

准确称取1.000 0 g甘草粉五份于具塞锥形瓶中，按1.3的提取方法，固定其它条件，改变时间分别为10、20、30、40、50 min，进行提取，得提取液，精确吸取样品提取液2 mL于10 mL的比色管中，按1.4的方法测定，结果如表4。

表4　提取时间对甘草黄酮得率的影响Table 4Effect of extracting time on yield of the licorice flavonoid

由表4所示，随着超声提取时间的增加，甘草总黄酮得率也在不断增大，当提取时间增大到30 min时，总黄酮得率达到最大值；再继续增加提取时间，总黄酮得率反而下降。这是因为刚开始随着时间的增加甘草中的总黄酮不断浸出，以至于达到30 min时，总黄酮得率达到最大；再继续延长提取时间，乙醇挥发量增大，溶解到乙醇中的总黄酮的量也减少，从而总黄酮得率会逐渐下降［10］，因此选择30 min作为超声提取的最佳时间。

2.7正交试验

在单因素考查的基础上，用正交试验法对提取因素如：固液比，醇水比，硫酸铵的质量浓度，超声提取时间进行优化，如表5，选用正交表对甘草总黄酮提取工艺进行研究。超声与乙醇-硫酸铵双水相体系耦合进行提取的条件的正交试验结果及极差分析见表6。

表5　正交试验的因素与水平Table 5Factors and levels in the orthogonal array design

表6　正交试验结果与分析Table 6Results and analysis of the orthogonal experiment

由表6正交试验直观分析结果可知，甘草总黄酮的最佳提取工艺条件为：A3B2C1D3，即固液比为1∶35，醇水比为0.7∶1，硫酸铵的质量浓度为0.25 g/mL，提取时间为40 min。从表2中极差可看出各因素对总黄酮的得率影响程度为：提取时间＞固液比＞质量浓度＞醇水比，即4个因素中，以提取时间对甘草总黄酮得率的影响最大。

2.8不同提取方法的比较

将本法与超声提取法进行比较研究，结果如表7所示。

由表7可知，本法的总黄酮得率明显高于常规的超声提取法，而且本法操作方便，无毒，条件温和，是非常适宜提取甘草总黄酮的操作方法。

表7　不同提取方法的比较Table 7The Comparison of different extraction methods

3结论

1）采用超声与乙醇-硫酸铵双水相体系耦合提取法甘草总黄酮的提取最佳工艺条件是：固液比为1∶35、醇水比为0.7∶1、硫酸铵的质量浓度为0.25 g/mL、提取时间为40 min，在此条件下总黄酮的得率达到1.96%。各因素对甘草总黄酮的提取率影响程度为：提取时间＞固液比＞质量浓度＞醇水比。

2）双水相体系耦合提取的甘草总黄酮，提取工艺比较简单，与常规超声提取法比较，总黄酮得率较高，该研究结果对中草药及天然植物中的有效成分具有一定的参考价值。

［1］中国药典委员会.中华人民共和国药典.2005年版［M］.北京:化学工业出版社，2006:205

［2］孙芸，阿依努尔·吾买尔，燕雪花，等.甘草黄酮的提取方法及药理作用研究进展［J］.新疆中医药，2009，27（7）:72-75

［3］邹玉红，寇小燕，韩秋霞.超声波辅助法提取甘草总黄酮工艺的研究［J］.安徽农业科学，2011，39（14）:8345-8347

［4］汪建红，廖立敏，王碧.乙醇-硫酸铵双水相体系提取柠檬渣中总黄酮研究［J］.华中师范大学学报，2013，47（1）:78-81

［5］钟玲，张越非，李小菊，等.乙醇/无机盐双水相体系分离纯化黄芪总黄酮的研究［J］.中国中药杂志，2012，28（22）:58-62

［6］高云涛，李干鹏，李正全，等.超声集成丙醇-硫酸铵双水相体系从苦荞麦苗中提取总黄酮及其抗氧化活性研究［J］.食品科学，2009，30（2）:110-113

［7］齐玉，孙波，赵晓，等.聚乙二醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取蛋清溶菌酶方法的建立［J］.中国家禽，2013，35（5）:22-26

［8］江咏，李晓玺，李琳，等.双水相萃取技术的研究进展及应用［J］.食品工业科技，2007，28（10）:235-238

［9］那吉，董学畅，王雪梅，等.超声波协同丙醇-硫酸铵双水相体系提取灯盏花总黄酮的研究［J］.化学与生物工程，2007，24（12）:51-53

［10］赵晓莉，岳红，张颖，等.柿叶黄酮在双水相体系中的分配行为［J］.林产化学与工业，2006，26（1）:83-86

Ultrasonic Coupling Extraction with Ethanol Ammonium Sulfate Aqueous Two-Phase System of Licorice Flavonoids in Research

LI Zhi-ying，ZHI Xin，ZHANG Yan，DONG Jing
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Liquorice as raw material，ultrasonic-ammonium sulfate aqueous two-phase system coupled with ethanol extraction flavonoids of glycyrrhiza powder.By single factor experiment and orthogonal experiment was carried out optimum conditions of licorice flavonoids.Results showed that the use of ultrasound-ammonium sulfate aqueous two-phase system coupled with ethanol extraction and separation of licorice flavonoids best process conditions for：solid-liquid ratio rising 1∶35；Alcohol water ratio of 0.7∶1.The quality of the ammonium sulfate concentration of 0.25 g/mL，extracting time 40 mins.In this condition，the licorice flavonoids extraction rate was 1.96%.Extraction efficiency by using double water phase system extraction was higher than that of conventional ultrasonic extraction.

ultrasonic extraction；aqueous two-phase systems；licorice；flavonoids；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.026

2014-01-06

忻州师范学院应用化学创新实践基地（院政字201331）；忻州师范学院大学生科技创新项目（2012.1022）

李志英（1970—），女（汉），教授，硕士，从事分析化学教学与科研工作。