鼠动静脉畸形模型在放射外科治疗后炎症分子的改变

苏海洋　申俊峰　罗雷雷等

[摘要] 目的 探索鼠模型动静脉畸形在放射外科治疗后血清中炎症分子的改变，为进一步寻找人类脑动静脉畸形对放射外科治疗反应的早期监测标志物奠定基础。 方法 将12只雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组，每组6只。利用显微血管吻合法进行造模，造模后42 d，利用酶联免疫吸附试验分别定量测定两组大鼠放疗前血清中可溶性E-选择素、P-选择素、细胞间黏附分子-1（SICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（SVCAM-1）、组织因子及实验组放疗后6、12、24、48、72、120 h血清中以上各因子的含量，并利用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。 结果 放疗后实验组大鼠血清可溶性E-选择素及P-选择素、SICAM-1、SVCAM-1及组织因子较放疗前及对照组升高。实验组放疗不同时间点各种炎症分子的表达有差异：放疗后6、12 h时，实验组血清中可溶性E-选择素的平均浓度较放疗前显著升高（P < 0.05）；放疗后6、12、24、48、72 h时血清中可溶性P-选择素的水平与放疗前比较显著升高（P < 0.05）；放疗后6 h和12 h时，血清中sICAM-1和sVCAM-1的浓度较放疗前均显著升高（P < 0.05）；放疗后6 h血浆可溶性组织因子浓度较放疗前升高1倍，在放疗后24 h内维持在高水平（P < 0.05）。 结论 在放射外科治疗动静脉畸形的过程中在不同时间点对以上炎症分子进行组合监测可作为早期预测动静脉畸形对于放射外科治疗反应的标志物。

[关键词] 动静脉畸形；模型；E-选择素；P-选择素；细胞间黏附分子-1；血管细胞黏附分子-1；组织因子

[中图分类号] R743.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（c）-0009-05

[Abstract] Objective To study serum inflammatory molecular changes in response to radiosurgery in rat model of arteriovenous malformation， and to find the early and effective marker to detect responsiveness after using radiosurgery for human AVMs. Methods 12 male SD rats were randomly divided into experimental group and control group， 6 rats in each group. The rat models of AVMs were built by microvascular anastomosis method， 42 days after modeling， soluble E-selectin and P-selectin， ICAM-1， VCAM-1 and tissue factor in animal model of AVMs were quantified by ELISA before radiosurgery of rats in two groups and 6， 12， 24， 48， 72， 120 hours after radiosurgery of rats in experimental group， and data were analyzed by SPSS 17.0 statistical software. Results Compared with the control group and experimental group before radiotherapy， the serum concentrations of soluble E-selectin and P-selectin， SICAM-1， SVCAM-1， and tissue factor of the rats in the experimental group were significantly increased. The expression of inflammatory molecular changes at different time point in rats of the experimental group had statistically significant difference： serum concentrations of soluble E-selectin were significantly increased at 6 and 12 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum levels of soluble P-selectin were significantly increased at 6，12， 24， 48， 72 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum concentrations of soluble ICAM-1 and VCAM-1 were significantly increased at 6 and 12 hours after radiosurgery （P < 0.05）； serum concentrations of soluble tissue factor were doubled at 6 hours after radiosurgery and maintained at high levels for 24 hours （P < 0.05）. Conclusion A combination of these molecules measured at different time points may serve as an early predictor of responsiveness of AVMs to radiosurgery.

[Key words] AVM； Model； E-selectin； P-selectin； ICAM-1； VCAM-1； TF

脑动静脉畸形（CAVMs）是中枢神经系统最常见的血管畸形疾病，具有较高的致死率和致残率，也是造成儿童及成人出血性脑卒中的主要原因之一。目前很多动静脉畸形（AVMs）可以通过手术及放射外科治愈，但接受放射外科治疗的患者因病灶对放疗无反应或放疗后血管闭塞不完全仍有导致出血的风险[1-2]。目前对于放疗后病灶监测的金标准是血管造影术，尚无简便可行的早期监测手段。因此，需要寻找简便可测的分子标志物来预测放疗后动静脉畸形血管的早期反应。根据前期对人脑动静脉畸形血管、鼠动物模型动静脉畸形血管内皮细胞的研究[3-7]，故可推断动物模型血管内皮细胞分子在放疗后的表达可能在转录水平升高及血液中可能检测到。本研究的目的是通过探索鼠动脉畸形模型在放射外科治疗后炎症分子的改变，确定动静脉畸形动物模型内皮分子变化的时间过程，为进一步寻找脑动静脉畸形对放射外科治疗反应的早期监测标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用SPF级雄性SD大鼠均由北京世纪坛医院动物实验中心提供，平均体重（364±12）g；显微手术器械（成套）购自宁波成和显微器械厂；手术显微镜（Zeiss，德国）；X-刀直线加速器（Radionics，Burlington，MA，USA）。酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自武汉优尔生科技股份有限公司。

1.2 模型建立及放射外科治疗方法

将12只雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组，每组6只。用标准化鼠笼饲养SD大鼠，每笼3只，1周换2次辅料。根据本研究组前期已发表的SD大鼠颈动静脉畸形模型制作[5]的手术方式将SD大鼠的左颈外静脉端侧吻合到左颈总动脉以建立动静脉畸形动物模型。显微血管吻合手术在严格无菌条件下进行。首先，麻妥后备皮消毒，暴露左颈总动脉（CCA）。然后，暴露左颈外静脉（EJV），用丝线（10-0）结扎左颈外静脉近锁骨下静脉处。用静脉夹夹闭大鼠EJV头端。用动脉夹夹闭CCA的近端及远端，将其血管壁侧面纵行切一小口，用丝线（11-0）将EJV的尾端与切口作端-侧吻合。完成吻合后检查吻合口是否渗漏及堵塞。吻合后形成1条供血动脉（颈总动脉）、1条动脉化静脉（左颈外静脉）、1处畸形团（“病灶”）及1条引流静脉（乙状窦及横窦）。逐层闭合切口。待大鼠苏醒后移至鼠笼单独饲养至术后1周。术后1周每天评估其体重、运动功能、行为以及伤口状态，以后每周评估1次。

术后42 d，肌内注射氯胺酮及咪唑达仑麻醉下对动静脉畸形处血管行放射外科治疗。根据大鼠呼吸频率评估麻醉深度，依据后肢回撤反应对痛觉反应进行评估。麻醉后，将大鼠置于X-刀直线加速器（Radionics）的头环下（图1），调整动物相对位置于计划照射的部位，确保瘘管置于3束激光交汇点处。同样的治疗方法适用于所有动物，对锁骨下区“病灶”处给予最大剂量25 Gy照射。对照组动物做相同手术处理，但不进行放射治疗。分别于放疗前（-1 h）及放疗后6，12，24，48，72，120 h抽取实验动物血样，以备检测。

1.3 观测指标及检测方法

大鼠可溶性E-选择素（sE-selectin）、可溶性P-选择素（sP-selectin）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子-1（SVCAM-1）及可溶性组织因子（sTF）的检测根据试剂盒说明书进行实验操作。将血清或血浆样品稀释10～20倍，置于包被有特异性兔抗大鼠抗体的ELISA板上孵育。清洗后，加入过氧化物酶标记的抗兔抗体。最后，所有实验套件中结合酶的活性用过氧化物酶底物四甲基联苯胺/过氧化氢底物来测定。450 nm处的吸光度由自动微板读数器（iMark，Bio-Rad Laboratories）测定。将450 nm波长读数减去570 nm处参照波长的读数以纠正微板计数的光学误差。每次测定的标准曲线用Microplate Manager 6软件绘制。标准曲线上样品浓度读数乘以稀释倍数即为实际样品浓度。各组内和各组间测定的精度分别控制在5%和7%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较，若各组方差齐，采用方差分析，如方差不齐则采用Mann-Whitney非参数检验评估。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放射介导的大鼠血清sE-selectin和sP-selection的变化

图2中显示了放射外科治疗诱导鼠模型动静脉畸形血清中可溶性E-selectin和P-selectin的改变。放射可以诱导形成sE-selectin和sP-selectin。实验组放疗前sE-selectin为（11.50±0.01）ng/mL，放疗后6 h升高到（20.60±0.01）ng/mL，放疗后6 h比放疗前升高了（78±1）%，放疗后12 h sE-selectin浓度的平均值为（16.95±0.01）ng/mL，比放疗前升高了（47±1）%，而在24 h时恢复到了正常水平，放疗后24、48、72、120 h血清sE-selectin浓度的平均值分别为（12.11±0.01）、（12.10±0.01）、（10.89±0.01）、（10.90±0.01）ng/mL。实验组血清sP-selectin的平均浓度在放疗前为（85.71±0.01），放疗后6、12、24、48、72、120 h分别为（164.27±0.01）、（278.56±0.01）、（644.27±0.01）、（385.70±0.01）、（207.14±0.01）、（100.00±0.01）ng/mL。可见sP-selectin在放疗后24、42 h时分别升高到了5倍和4倍。在放疗后120 h时，sP-selectin恢复到正常水平。对照组血清sE-selectin和sP-selectin平均浓度分别为（11.49±0.01）、（84.85±0.01）ng/mL，与实验组放疗前血清浓度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 放射介导的ICAM-1和VCAM-1的改变

图3中显示了鼠模型动静脉畸形中经放射外科诱导的血清sICAM-1和sVCAM-1的改变。实验组sICAM-1的血清平均浓度在放射前为（30.88±0.01），放疗后6、12、24、48、72、120 h分别为（47.79±0.01）、（59.97±0.01）、（37.50±0.01）、（34.55±0.01）、（31.61±0.01）、（31.60±0.01）ng/mL。可见sICAM-1为在放疗后6 h升高了（57±2）%（P < 0.05），12 h时升高到约2倍，在放疗120 h时恢复到正常水平。实验组血清中sVCAM-1平均浓度在放疗前为（6.87±0.01）ng/mL，放疗后6、12、24、48、72、120 h分别为（11.25±0.01）、（13.54±0.01）、（10.20±0.01）、（7.71±0.01）、（7.08±0.01）、（7.04±0.01）ng/mL。可见放射6 h后，血清中sVCAM-1升高了（63±1）%（P < 0.05），12 h时，升高至约2倍，放疗后24 h时升高（48±1）%，并于120 h恢复至正常水平。对照组血清sICAM-1和sVCAM-1平均浓度分别为（30.25±0.01）、（6.83±0.01）ng/mL，与实验组放疗前血清中浓度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 放射介导的血浆中sTF的变化

图4显示了鼠模型动静脉畸形血液中放射诱导的血清sTF的变化。实验组sTFs的血清平均浓度在放疗前为（28.79±0.01）ng/mL，放疗6、12、24、48、72、120 h分别为（59.84±0.01）、（50.00±0.01）、（40.91±0.01）、（30.30±0.01）、（31.06±0.01）、（30.91±0.01）ng/mL。可见sTF在放射6，12，24 h后分别升高了（110±6）%、（76±4）%、（42±4）%（P < 0.05），放疗后6 h，血浆sTF浓度较放疗前升高了1倍，在120 h时恢复至正常水平。对照组血清sTF平均浓度为（28.32±0.01）ng/mL，与实验组放疗前血清浓度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3讨论

根据前期利用免疫组化和透射电子显微镜研究放射诱导的人脑动静脉畸形病灶、鼠动静脉畸形模型血管的形态学结构及血管内皮分子表达的研究[3-7]。本研究假设，鼠模型动静脉畸形血管内皮分子可能在转录水平上调，放疗后可能在血清或血浆中检测出来，同时，内皮蛋白分子可能对于监测动静脉畸形血管对放射治疗的反应性方面有预测功能。本研究发现大鼠动静脉畸形模型中，放射可以诱导血清中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1和血浆sTF水平的上调。放疗后血浆中可溶性内皮分子检测时间是决定性因素。放射诱导血清中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1及sTF的水平具有时间依赖性。放射诱导的炎症分子包括sE-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1[8-9]，它们与sP-selection共同介导了白细胞在内皮上缓慢翻滚最终牢固地黏附[10]。ICAM-1在淋巴细胞的归巢和迁移中起着重要作用。动静脉畸形血管中存在多种因素可以刺激E-选择素（E-selectin）、ICAM-1、VCAM-1的表达[11]。这些刺激因素可以与放疗产生协同作用进一步促进E-选择素、细胞间黏附分子和ICAM-1表达的上调[12]，从而使得内皮分子表达更具特征性。放疗后早期效应是内皮细胞E-selectin、P-selectin、ICAM-1和ICAM-1表达水平的上调。这些内皮分子共同介导了白细胞在动静脉畸形血管中内皮上的翻滚、捕获和迁移。放射介导的动静脉畸形血管炎性反应在诸如内皮细胞死亡，细胞增殖以及血栓形成等进程中也起着重要作用。

放射可以诱导人脑动静脉畸形病灶中血栓的形成。放射也可以影响在凝血和血栓形成过程中发挥重要作用的各种分子的表达[13-15]，如组织因子（TF）、血管性血友病因子和P-selectin[16-19]。TF正常表达于内皮下及血管外膜。大鼠动静脉畸形经放疗后，血管内皮损伤，导致内皮下成分暴露于管腔，从而将TF直接释放到血液中[3，8]；因此，经放射的模型血浆中可检测到sTF，且其浓度变化具有时间依从性。血管腔内出现的TF与闭塞性血栓形成反应有关。内皮下暴露的TF在介导动静脉畸形血管血栓形成过程中发挥重要作用。因此，血浆中sTF水平可以早期预测动静脉畸形病灶对放射治疗是否有反应。目前本实验通过对动物模型动静脉畸形血管对放疗后早期反应的研究累积了一些有用的数据，这些数据为进一步探索用于检测放射治疗后早期反应性的生化标志物奠定了基础。

综上所述，本研究证实了放射可介导大鼠模型动静脉畸形中sE-selectin、sP-selectin、sICAM-1、sVCAM-1及sTF表达升高。因此，在不同时间点测定sP-selectin、sICAM-1、sICAM-1和sTF的水平，可用来评估动静脉畸形对放射治疗的反应性。

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（收稿日期：2015-06-04 本文编辑：任 念）