解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究进展

陈哲 黄静 赵佳 王长彪 梁宏

（山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031）

解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究进展

陈哲 黄静 赵佳 王长彪 梁宏

（山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031）

解淀粉芽孢杆菌能够产生种类繁多的抑菌物质，可以有效的抑制真菌和细菌的活性。近几年来，关于解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究报道越来越多，大部分研究已经深入到分子水平。综述了国内外有关解淀粉芽孢杆菌的全基因组信息和解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的相关研究。

解淀粉芽孢杆菌；基因组；抑菌机制

目前，在生物防治菌中人们研究较多的是芽孢杆菌。芽孢杆菌是土壤和自然界的优势微生物种群，广泛存在于自然界中，大多为非致病性细菌，对人畜无害，并且很多种类都具有抑制植物病害生长的能力。芽胞杆菌大多为内生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力强，易定殖在植物根际表面。芽孢细菌种类繁多，广泛应用于生物防治的种类有枯草芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌及解淀粉芽孢杆菌［1］。目前关于生防菌的基础研究集中在抑菌物质的种类、产生条件和分离纯化等方面，随着部分菌株全基因组测序的完成，研究已经逐步深入到分子水平，研究者开始关注抑菌物质产生的相关基因簇以及研究单个基因或者某几个关联基因对于抑菌物质分泌的影响等。已经有研究成功的通过Genome shuffling得到能大量分泌抑菌物质的突变菌株，改造后的突变菌株F2-38，surfactin的摇瓶产量比对照提高了3.5倍，在发酵罐中产量提高了10.3倍，而荧光定量（fluorescent quantitation，FQ）RT-PCR分析证实，菌株F2-38的surfactin合成酶基因srfA的表达量时原始菌株的15.7倍［2］。本文主要对国内外解淀粉芽孢杆菌的抑菌基因和抑菌机制的研究进展进行简要综述，对于今后工作的开展有重要意义。

1 解淀粉芽孢杆菌的全基因序列

1.1 解淀粉芽孢杆菌的基因组信息预测

从2007年解淀粉芽孢杆菌FZB42基因组序列的公布开始，已经有大约20多株不同的解淀粉芽孢杆菌进行了全基因组测序。

作为首个被测序的菌株，对解淀粉芽孢杆菌FZB42基因组序列的研究最为深入，其主要特征在表1中列出，同时还与枯草芽孢杆菌基因组进行了比较。解淀粉芽孢杆菌FZB42可以编码3 693个基因，与芽孢杆菌属的其他成员相比，其中有310个基因是其特有的［3，4］。

2013年，解淀粉芽孢杆菌UCMB5036完成测序，其基因组大小是3 910 324 bp，G+C的比例为46.60%，预测有3 660个编码序列（CDSs），89个tRNA基因序列，10个 rRNA操作子，预测包含3 842个预测的开放阅读框（ORF），其中95.39%的序列与菌株FZB42基因组序列具有同源性，这表明这两个菌株之间有高度的基因同线性（gene synteny）［5］。

表1 解淀粉芽孢杆菌FZB42基因组与枯草芽孢杆菌的主要特征比较

1.2 抑菌物质的相关基因簇

根据解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组序列信息，我们发现解淀粉芽孢杆菌可以产生种类繁多的次级代谢产物，这些产物可以抑制植物根际中的有害细菌和真菌。在解淀粉芽孢杆菌的基因序列中有9个巨大基因簇可以指导合成生物活性肽和聚酮化合物，二者分别在非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）的组织下合成（表2）。非核糖体肽合酶（NRPS）是由许多功能模块组成的复杂酶合成体系［6］，模块的数量、种类和排列顺序决定了最终产物具有多样性的结构、功能和作用机制。聚酮化合物的生物合成途径遵循和脂肽合成途径一样的规则［7］。

表2 参与非核糖体合成途径的基因簇

在解淀粉芽孢杆菌FZB42中，能够合成次级代谢产物的基因总长为340 kb，约占总遗传力的8.5%，是枯草芽孢杆菌的两倍［8］。而且在枯草芽孢杆菌中没有发现负责合成脂肽bacillomycin D，聚酮化合物difficidin 和macrolactin以及一种未知肽链的相关基因簇［7］。

同样的，解淀粉芽孢杆菌UCMB5036的基因组序列中也包含了非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）和聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因簇：surfactin、fengycin、difficidin、bacilysin、macrolactin、bacillaene、bacillomycin D 和bacillibactin，这些基因簇负责菌株次级代谢产物的产生。此外，菌株UCMB5036基因组中还包含其他功能的基因：分解代谢的植物来源的化合物、耐重金属和药物、运动和趋化、根定植，以及其他可以使细菌具有植物共生优势的功能［5］。

1.3 核糖体合成途经的相关基因

与脂肽和聚酮化合物相比，蛋白质类及酶类的抑菌物质合成所涉及的基因就相对简单许多，并且合成过程也很明确，遵循一般蛋白质的核糖体合成过程。值得注意的是，在枯草芽孢杆菌中羊毛硫抗生素lantibiotics（mersacidin和 subtilin）是常见的由核糖体合成的细菌素，但是解淀粉芽孢杆菌FZB42却不能合成这种物质，基因组中没有相应的编码基因，但是却有阻碍其合成的基因簇［4］。

2 抑菌机制的研究

目前，关于抑菌物质的抑菌机理有一定的研究，但还是没有形成完整的体系。一般来说，抑菌物质可能在会在3个方面起作用：对病原菌的生长起到抑制作用；诱导植株的体内基因和免疫系统发生变化；抑菌物质使得拮抗菌具有一定特性，通过菌体的运动定殖在植株根部，发挥抑制作用。

2.1 对病原菌的作用

抑菌物质对病原菌的抑制主要体现在对其菌丝生长的抑制，以及对孢子萌发的影响这两方面。

解淀粉芽孢杆菌YN- 1能够抑制棉花枯萎病菌，用菌株发酵液的粗提物处理病原菌，结果表明，YN -1菌株粗提液能够造成该病原菌的菌丝消融、变细，菌丝膜发生破裂，原生质体凝集渗漏，菌丝体扭曲变形，形成泡囊结构，孢子的产生受到严重抑制［9］。

利用高效液相色谱HPLC分析发现，解淀粉芽孢杆菌SWB16能够分泌脂肽类抑菌物质芬枯草菌素和伊枯草菌素。试验证明，这两种物质可以抑制球孢白僵菌生长：一方面对孢子发芽及生长具有明显的抑制及破坏作用，绝大多数分生孢子裂解，出现内容物外溢现象；另一方面，菌丝前部生长端出现膨大现象，菌丝体出现多处出现瘤状畸形，菌丝生长受到明显抑制［10］。

通过试验发现，用纯脂肽芬枯草菌素fengycins处理串珠镰刀菌后，菌丝体内出现较大的囊泡，部分菌丝顶端破裂，菌丝膜也会受到破坏。但是，fengycins不容易破坏串珠镰刀菌孢子的膜透性。此外，还发现卵磷脂很可能是fengycins在膜上的作用靶标，并且，fengycins能够抑制串珠镰刀菌分泌的磷脂酶A2的活性，该性质很可能也在fengycins的抑菌活性中起到了一定作用［11］。

2.2 对植株的作用

当菌株在植物根际定殖或大量繁殖时，抑菌物质可能会促使植物体内发生改变。例如，诱导免疫系统中的酶发生变化，或者系统抗病性发生变化。

有研究者对拮抗细菌 C-02 防治棉花黄萎病的机理展开了研究。结果表明，菌株C-02处理棉苗后，棉叶中植株防御性酶系中的苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO的活性提高幅度大，维持时间长，提高了棉苗系统防御能力，降低了病原菌侵染的可能性［12］。

诱导性系统抗性（ISR）是由寄生在植物根部的有益菌，或者称为植物生长促进菌诱导植物产生的、对逆境和病害的系统抗性。研究表明，当受到温度或者水分胁迫时，植物的诱导性系统抗病性（ISR）水平会下降；如果事先用解淀粉芽孢菌株S499对植株进行处理，就能够降低这种负面影响。分析证实，在低温情况下，解淀粉芽孢杆菌S499菌株的surfactin产量会显著提高，增加菌株在植株根部的定殖能力，从而使得植物诱导性系统抗病性ISR的水平能维持平衡。许多试验表明，surfactin与菌株在植物根际的活动，包括定殖能力、丛集运动以及生物膜的形成有关得以实现［13］。

2.3 抑菌物质自身的抑制作用

解淀粉芽孢杆菌分泌的抑菌物质有很多种，常见的种类分为脂肽类物质、聚酮类物质还有具有蛋白活性的抑菌物质。它们可以通过影响菌体自身的丛集运动、定殖能力、生物膜形成能力，促使菌体在植物根际大量繁殖或者定殖，进而起到保护作用。目前研究较多的是脂肽类的抑菌物质，解淀粉芽孢杆菌SQR9可以合成bacillomycin D和fengycin两种脂肽，对香蕉枯萎病菌有显著的拮抗作用。根据菌株SQR9分合的两种物质，研究构建了两种突变体：bacillomycin D 合成能力受到阻碍的突变体SQR9M1，对尖孢镰刀菌有轻微的抑制作用；fengycin合成能力受到阻碍的突变体SQR9M2，其抑菌能力等同于野生型菌株SQR9。此外，通过在根部的原位实验以及定量RT-PCR实验证实，bacillomycin D有助于生物膜的形成［14］。

解淀粉芽孢杆菌FZB42的自发GFP荧光的突变体FB01mut可以用来研究菌株在不同物种中的定殖情况。在玉米中，突变体FB01mut主要定殖在初生根外表细胞的表面以及初生根和侧根的交界处；而突变体FB01mut在拟南芥定植定植时，优先定殖于根尖；对于浮萍，突变体FB01mut通过形成生物膜定殖在叶子和根部，从定殖菌的浮萍植株上只提取到了表面活性素surfactin［15］。

还有研究者采用绿色荧光蛋白标记解淀粉芽孢杆菌FZB42发现，该细菌定植在不同物种的植物的根的表面表现不同。为了阐明哪些基因是根定植的关键，实验构建了一系列突变体，即abrB-、sigH-、sigD-、nrfA-、yusV、RBAM017410、sfp、pabB-、pznA-和degU。用共聚焦激光扫描显微镜进行扫描分析发现，野生型菌株大量定殖在根尖和侧根的表面，而突变体定殖在根尖的能力受到了影响，并且大多数突变体不能在侧根定殖。其中，sfp、pabB-、pznA-和 degU基因被敲除的突变体菌株影响了细菌形成生物膜的能力以及菌体的群集运动，从而影响其在根部定殖的能力，这与大多数研究结果一致。有趣的是，菌株在植物根部的定殖能力依赖于生物膜的形成能力及群集运动。例如，试验中构建的6个突变体，abrB-、sigH-、sigD-、 nrfA-、yusV和RBAM017410，它们在根部的定殖能力显著下降，但是却没有影响菌株生物膜的形成，而且突变株nrfA-和yusV虽然不能在根尖或者或侧根定殖，但是却可以定殖在细胞边缘及根的表面［16］。

为了研究菌株和根系表面接触的分子机制，采用cDNA为基础的消减抑制杂交，在解淀粉芽孢杆菌B55中鉴定出了7个上调的差异表达DNA片段。进一步试验表明，在解淀粉芽孢杆菌B55和水稻根部共培养1 h之后，ansB（天门冬氨酸氨-裂合酶）和odhA（2-酮戊二酸脱氢酶E1组分）基因的RNA表达上调；随着菌株和植物互相作用的时间增长，odhA基因呈连续上调表达，而ansB则在2 h后发生下调表达，这表明与水稻根部接触的早期，ansB的上调表达是瞬间。可以看出，在细菌与植物根际相互作用的初期，会受到植物根系分泌物和根际微生物表面接触的影响，这一时期是根际细菌定殖根部的关键时期，同时也开始促进植物的生长［17］。

需要注意的是，尽管我们能够将抑制机理大致分为以上3种情况，但是在大自然中，抑菌物质在病原菌、植株和菌体三者之间发挥抑制作用一定依赖一个复杂而精细的调控网络，这个网络是我们今后研究的主要任务，尤其是在分子水平上的抑菌原理还需要进行更透彻的研究，包括基因表达和蛋白质组学的研究等，逐渐构建出完整系统的抑菌调控体系，为抑菌物质更好的发挥作用奠定良好的分子基础。

3 展望

到目前为止，解淀粉芽孢杆菌的抑菌作用研究已经广泛开展，但是生物体是复杂多变的，仍然有很多东西是未知的，并且利用解淀粉芽孢杆菌进行生物防治的前景十分广阔，所以要加强对抑菌物质的分子研究。未来，抑菌物质的分子研究应该集中在以下几个方面：研究抑菌调控体系，明确抑菌物质在病原菌、植株和菌体三者之间发挥作用的机制；改良合成抑菌物质的相关基因，使菌株产生更多的抑菌物质，从而有更强的抑菌能力；找到抑制病原菌生长的关键基因，将其转入到植物中，使得植物本身具有抵抗病原菌的能力；使用高表达的宿主菌进行抗菌物质的高效表达，开展抑菌物质生物制剂的研究，包括制剂的规模化生产、储存条件、存活期限、施用方法以及施入土壤后的存活条件和繁衍系数等方面；还可以通改造已知抑菌物质的结构，人工合成抗菌物质，从而在植物真菌的生物防治中发挥不亚于天然抑菌物质的作用［18］。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Advances on Antibacterial Mechanism of Bacillus amyloliquefaciens

Chen Zhe Huang Jing Zhao Jia Wang Changbiao Liang Hong
（Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agriculture Science，Taiyuan 030031）

Bacillus amyloliquefaciens produces a wide range of antibacterial substances which effectively inhibit fungal and bacterial activities. In recent years， more and more studies have focused on antibacterial mechanism of B. amyloliquefaciens， and most of them already at the molecular level. Hence， we review the research progress on the genome sequences and antibacterial mechanism of B. amyloliquefaciens in this study.

Bacillus amyloliquefaciens；genome；antibacterial mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.004

2014-09-16

山西省农业科学院产品项目（2012ycp18），山西省基础研究计划项目（2009021032-1），山西省农业科学院科技攻关项目（2013GG22）

陈哲，女，研究实习员，硕士，研究方向：拮抗菌抑菌物质；E-mail：changer0006@163.com

梁宏，助理研究员，研究方向：微生物；E-mail：lh1964@126.com