高效液相色谱法柱后衍生法测定陈皮中黄曲霉毒素

魏莹，李文东，杨兰，李红君，陈光华，刘福

（1.川北医学院药学院，四川南充637000；2.川北医学院附属医院药剂科，四川南充637000）

高效液相色谱法柱后衍生法测定陈皮中黄曲霉毒素

魏莹1，李文东2，杨兰1，李红君2，陈光华2，刘福2

（1.川北医学院药学院，四川南充637000；2.川北医学院附属医院药剂科，四川南充637000）

目的考察医院药房中不同批次陈皮饮片中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，为确保陈皮饮片的临床用药安全。方法采用高效液相色谱法（HPLC）-碘柱后衍生化-荧光检测方法测定陈皮样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量，色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速为0.8mL/min，荧光检测，激发波长360 nm，发射波长450 nm。柱后碘衍生化系统为衍生溶液为0.05%的碘溶液，流速为0.3mL/min，衍生化反应器温度为70℃。结果药房现存5批次陈皮样品均未检出黄曲霉毒素；黄曲霉毒素G2，G1，B1，B2进样量分别在108～1 085 ng，217～2 171 ng，191～1 913 ng，64～644 ng范围内与峰面积线性关系良好，加样回收率在60%～110%之间。结论该方法准确、可靠，可作为陈皮中黄曲霉毒素的含量测定方法。

黄曲霉毒素；陈皮；碘柱后衍生化；免疫亲和柱；高效液相色谱法

黄曲霉毒素（AFT）被世界卫生组织的癌症研究机构（IARC）列为Ⅰ类致癌物质，主要是由黄色曲霉菌和寄生的曲霉菌等真菌产生的次级代谢产物［1-2］。黄曲霉毒素主要有B1，B2，G1，G24种，其中黄曲霉毒素B2毒性最强［3］。中药材在采收贮存加工和炮制过程处理不当，容易滋生霉菌并被其产生的黄曲霉毒素所污染［4-5］。陈皮作为传统中药，来源于芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰的功效［6］，主要用于治疗胸腹胀满、痰多咳嗽、消化不良以及恶心呕吐等症［7-9］。但陈皮在加工储存过程中，由于温度和湿度等环境影响，很容易霉变而产生如黄曲霉等真菌，这些微生物代谢从而产生黄曲霉毒素。陈皮陈列在医院药房的药斗内，由于四川空气潮湿且药斗的密闭性较差，故陈皮在此过程很容易受潮霉变。笔者为确保陈皮饮片的临床用药安全，采用免疫亲和柱净化样品后高效液相色谱法（HPLC）-柱后碘衍生化-荧光检测方法对本院药房中不同批次陈皮中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2进行了含量测定，现报道如下。

1　仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪（Agilent 1260四元泵、柱温箱、VWD检测器、色谱工作站）；Agilent1200型荧光检测器；Vector PCX衍生化仪；78-1磁力加热搅拌器（上海浦东物理光学仪器厂）；瑞士Mettle AE240型电子天平（万分之一）；AflaStar FIT黄曲霉毒素总量免疫亲合柱（1mL）。黄曲霉毒素混合标准品溶液（国家食品药品鉴定研究院，批号610001-201301，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2质量浓度分别为1.04，0.35，1.18，0.59μg/mL）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。陈皮饮片购于四川省中药饮片有限公司，经江西中医药大学杨武亮教授鉴定为芸香科植物茶枝柑Citrisreticulata Chachi的干燥成熟果皮。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；荧光检测激发波长360 nm，发射波长450 nm；进样量：20μL。色谱图见图1。

图1　高效液相色谱图

2.2柱后碘衍生化

以0.05%的碘溶液为衍生溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100mL使溶解，用水稀释定容至1 000mL，即得），流速为0.3mL/min，衍生化反应温度为70℃。

2.3溶液制备

精密量取黄曲霉毒素混合标准品0.92mL，置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置，制成混合对照品贮备液，其中含黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的质量浓度分别为95.68，32.2，108.56，54.28 ng/mL。取陈皮粉末约5 g（过2号筛），精密称定，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75mL，震荡30min（速度160 r/min），静置30min后，精密吸取上清液15mL，置50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过。量取续滤液20mL，通过免疫亲合柱（流速3mL/min），用水20mL洗脱（流速3mL/min），洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1.5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置2mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置，即得供试品溶液。

2.4方法学考察

线性关系考察：在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品贮备液2，4，8，16，20μL进样，测定峰面积，以峰面积Y为纵坐标、进样量（X，pg）为横坐标进行线性回归，得黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的线性回归方程分别为：Y=0.05X+1.2（r=0.999 5）；Y= 0.105X+0.43（r=0.999 9）；Y=0.037X+0.09（r=0.999 9）；Y=0.05X+0.01（r=0.999 8），其线性范围分别是191～1 913 ng，64～644 ng，217～2 171 ng，108～1 085 ng。

精密度试验：精密吸取同一混合对照品溶液20μL，连续进样6次。结果以黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的峰面积计算的RSD分别为0.7%，0.6%，2.0%，0.7%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：按2.3项下方法，制备供试品溶液，精密加入混合对照品溶液0.5 mL，在上述色谱方法下，分别于0，2，4，8，12 h时进样。结果以黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的峰面积计算RSD分别为0.2%，0.4%，0.2%，0.2%（n=5），表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：按2.3项下方法，平行制备供试品溶液5份，分别精密加入混合对照品贮备液0.5mL，在上述色谱方法下进样分析。结果黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2峰面积的RSD分别为0.2%，0.4%，0.2%，0.2%（n=5），表明方法重复性良好。

检测限和定量限确定：倍比稀释一混合对照品溶液，在信噪比为3时，测得黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的检测限分别为143.52，96.6，162.84，81.42 ng；在信噪比为10时，测得黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的定量限分别为382.72，128.80，434.24，217.12 ng。

加样回收试验：取陈皮粉末5 g，共6份，分别加入混合对照品溶液0.5mL（即相当于10.0μg/kg），在上述色谱方法下进样分析，结果见表1。与文献［10］提示，当添加浓度在1～10μg/kg时，回收率范围为60%～115%相符。

表1　加样回收试验结果（n=6）

2.5样品含量测定

取5批样品（批号分别为130304，140120，140324，140415，140611），精密吸取供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，由回归方程计算出样品中相当于黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的量，结果，5个批次的样品中均未检测到G2，G1，B2，B1。

3　讨论

本院药房5个批次的陈皮饮片样品均未检出黄曲霉毒素。本院药房各批次陈皮饮片从生产到药房流通时间是1～2年，均有不同程度的受潮，但均未霉变，即未产生黄曲霉毒素。但鉴于黄曲霉毒素的危害极大，陈皮药材在临床入药是都应该进行必要的安全性评价，保证陈皮临床安全用药。免疫亲和净化HPLC-柱后碘衍生化-荧光检测法具有方法简便、衍生反应稳定、灵敏度高、重现性好等优点，可作为陈皮中黄曲霉毒素的含量测定方法。

［1］Elisabete YS，Mario A，Fabia Y，etal.Evluation of fumonisin-aflatoxin cooccurrence in Brazilian corn hybrids by ELISA［J］.Food Addit Contam，2001，18（8）：719-729.

［2］赵飞，焦彦朝，连宾，等.黄曲霉毒素检测方法的研究进展［J］.贵州农业科学，2006（5）：123-126.

［3］郝爱鱼，赵丽元，刘英慧，等.HPLC柱后光衍生荧光法测定中药饮片中黄曲霉毒素残留量［J］.药物分析杂志，2012，32（12）：2 203-2207.

［4］栗建明，李纯，顾利红，等.高效液相色谱柱后衍生法测定果实类药材中的黄曲霉毒素［J］.中药新药与临床药理，2011，7（22）：461-464.

［5］吴琼.改进饮片加工包装及贮藏保管的探讨［J］.内蒙古中医药，2010（3）：86-87.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：191.

［7］官福兰，王如俊，王建华.陈皮及橙皮苷对离体肠管运动的影响［J］.时珍国医国药，2002（2）：65-67.

［8］郭建生，陈君，聂子文，等.陈皮不同提取物对寒凝气滞胃实寒模型大鼠的影响［J］.中成药，2012，34（6）：1 158-1160.

［9］李红芳，李丹明，瞿颂义，等.枳实和陈皮对兔离体主动脉平滑肌条作用机理探讨［J］.中成药，2001，23（9）：658-660.

［10］Codex Alimentarius Commission ProceduralManual（Twentieth edition）. JointFAO/WHOFood StandardsProgramme［M］.Rome：World Health Organization Food AgricultureOrganizationoftheUnited Nation，2011：66.

Determ ination of Aflatoxins in Citri Reticulatae Pericarpium by HPLC w ith Post-column Derivatization

Wei Ying1，Li Wendong2，Yang Lan1，Li Hongjun2，Chen Guanghua2，Liu Fu2
（1.College of Pharmacy，North Sichuan Medical University，Nanchong，Sichuan，China 637000；2.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of North
Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan，China 637000）

Objective To investigate the content of aflatoxin B1，B2，G1，G2in different batches Citri Reticulatae Pericarpium，in order to ensure the safety of clinical use.M ethods The content of aflatoxin B1，B2，G1，G2was determined by HPLC with post-column derivatization.The chromatography was performed on a Diamonsil C18column（150 mm×4.6 mm，5 um），with methanol-acetonitrile-water（40∶18∶42）as the mobile phase，the flow rate was 0.8 mL/min；fluorescence detection，the excitation wavelength was 360 nm，the emission wavelength was 450 nm.The 0.05%iodine solution was used as the derivatization reagent，which was delivered at a flow rate of 0.3 mL/min and the reaction coil was maintained at 70℃.Results There were no aflatoxin was determined in the Citri Reticulatae Pericarpium.The linear range of aflatoxin G2，G1，B1and B2were 108-1085 ng，217-2171 ng，191-1913 ng，64-644 ng，respectively.The recover rate was 60%-110%.Conclusion Aflatoxin was not detected in Citri Reticulatae Pericarpium which was safety and can be used for clinical prescription.The method is accurate and reliable，which can be used to control the content of aflatoxin in Citri Reticulatae Pericarpium.

aflatoxins；Citri Reticulatae Pericarpium；post-column derivatization with iodine；immunoaffinity columns；HPLC

R286.0；R282.71

A

1006-4931（2015）24-0160-03

魏莹（1987-），女，硕士研究生，研究方向为中药质量标准与研究，（电子信箱）414697669@qq.com。

2015-08-13）