重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

郑娟郭怀祖李晶段树燕赵自叶张大鹏郭尚敬王皓

（1. 聊城大学药学院，聊城 252000；2. 抗体药物与靶向治疗国家重点实验室，上海 201203；3. 第二军医大学肿瘤研究所，上海 200433）

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

郑娟1，2郭怀祖2，3李晶2，3段树燕1，2赵自叶1，2张大鹏2，3郭尚敬1王皓2，3

（1. 聊城大学药学院，聊城 252000；2. 抗体药物与靶向治疗国家重点实验室，上海 201203；3. 第二军医大学肿瘤研究所，上海 200433）

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶，能选择性切割天冬氨酸的N端肽键，广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌，产量低，制备困难，成本高，极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶AspN所对应的基因克隆入表达载体pET32a，导入E.coli BL21（DE3），首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达，亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe（NO2）-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶AspN具有与标准品基本一致的酶切活性，能够较好地应用于生物和制药领域。

重组内肽酶AspN；原核表达；纯化；活性鉴定

内肽酶AspN（flavastacin EC=3.4.24.76）是一种锌金属内切肽酶，能选择性切割天冬氨酸残基的N端肽键，其来源于脑膜脓毒性黄杆菌分泌表达，含有443个氨基酸，分为3部分，即信号肽、前肽和具有酶切活性的flavastacin。其中第1-91位氨基酸是信号肽部分［1］，通过这个信号肽脑膜脓毒性黄杆菌将该蛋白酶分泌出胞外［2，3］；第190位谷氨酸是酶活性中心，第189位、193位和199位的组氨酸是锌金属结合位点，起催化作用［4，5］。天然酶在革兰氏阴性菌脑膜毒性黄杆菌分泌时含有O-连接的糖基化位点修饰［6］，其具体功能尚不明确。该酶能够选择性切割天冬氨酸N端肽键［7］，广泛应用于生物制药和生产［8-10］，特别是蛋白或多肽的制备以及蛋白的肽图谱及质量肽图鉴定［11，12］。目前应用的内肽酶AspN主要来自于宿主菌的提取，其制备过程复杂，表达量低，纯化困难，且纯度不高，成本昂贵，极大地限制了该酶在生物及医药领域的应用，近年来对该酶的研究尚未有突破的进展。开发重组表达的工艺来进行高效率低成本地制备蛋白内肽酶AspN已经成为解决当前问题的关键［13-15］。大肠杆菌因其高效、廉价而成为重组蛋白的最佳宿主。大肠杆菌表达重组蛋白广泛应用于外源蛋白的表达［16-18］。然而大肠杆菌表达重组蛋白极易形成包涵体，即使是可溶性表达成活性酶，也会对宿主菌产生较大的毒性。故在本研究中通过Trx融合表达方式，既可以可溶性表达，也可以在一定程度上抑制酶的活性，同时6个His标签利于蛋白的纯化。本研究经过全基因合成蛋白活性肽段所对应的核苷酸序列，构建AspN/pET32表达载体。首次采用Trx融合表达的方式进行AspN的可溶性表达，经过镍金属螯合层析柱进行一步亲和层析获得高表达的融合蛋白，然后通过缓冲液置换及酶的自激活从而制备出高纯度的目的蛋白。运用HPLC、SDS-PAGE和荧光试验对重组酶进行酶活鉴定，结果表明该重组AspN具有与和天然提取的标准品基本一致的酶切活性。这种重组内肽酶AspN-Trx具有制备简单，表达量、纯度高的特点，为该酶广泛应用于蛋白多肽制备、肽图谱鉴定、晶体结构研究及活性作用机制研究奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和菌株 载体：原核表达载体pET/32a为实验室保存；菌株：大肠杆菌TG1和BL21（DE3）均为实验室传代保存。

1.1.2 试剂与材料 限制性内切酶BamH I和Xho I购自日本TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自美国Promega公司；DNA marker DL2000 Hind III为华美公司产品；蛋白marker购自Thermo Sciencific公司。小量质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自上海生工技术有限公司；Goldview购自北京天根生物技术有限公司；琼脂糖购自上海实生细胞生物技术有限公司；细菌培养试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自英国Oxiod公司；氨苄青霉素粉末购自北京制药有限公司；丙烯酰胺胶浓缩液、过硫酸铵、TEMED均购自上海博光生物技术有限公司；镍金属螯合层析柱和凝胶过滤层析G25 脱盐柱均购自GE公司；荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe（NO2）-Tyr-Asp是通过上海紫域生物有限公司合成；标准内肽酶AspN购自NEB公司；组蛋白为本实验室自行提取，重组西妥昔单克隆抗体为本实验室自行表达与纯化。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获取 文献报道内肽酶AspN是通过脑膜脓毒性黄杆菌分泌上清纯化得到的［6］通过uniprot数据库获得目的蛋白的氨基酸序列。由于本研究运用原核胞内融合表达系统，故将前端信号肽及前肽部分予以去除。成熟部分蛋白的氨基酸序列如下：

将氨基酸序列转换为核苷酸序列并根据其在大肠杆菌翻译中常用的密码子进行密码子优化，以避免稀有密码子的出现。优化后的核苷酸序列由Invitrogen公司合成。

1.2.2 表达载体的构建 将全基因合成的基因片段从连接的pMD18-T载体上用限制性内切酶BamHI和Xho I将目的片段酶切，胶回收目的片段；用T4 DNA连接酶将目的基因插入到BamH I和Xho I酶切的表达载体上，通过酶切鉴定和DNA测序筛选正确的克隆。

1.2.3 融合蛋白的诱导表达 将正确的重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）。将含有重组质粒的表达菌接种到试管扩大培养至OD600为0.6左右时，菌液进行分管诱导，检测诱导IPTG终浓度（0.01、0.05、0.1、0.2 mmol/L）、诱导温度（16℃、25℃、30℃、37℃）、诱导时间（3、6、9 h 过夜）对重组内肽酶AspN可溶性表达量的影响。每个时间点，各取1 mL的菌液，离心弃上清，用200 μL 1× PBS悬浮，超声破碎的菌离心后得到上清和沉淀。上清直接取样，沉淀用200 μL 1×PBS悬浮。各取样10 μL，非还原的样品加入10 μL 2×loading buffer，还原样品加入8 μL 2×loading buffer和2 μL 1 mol/L DTT。样品95℃加热5 min后，用12%的SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

1.2.4 融合蛋白的纯化 按照最优的诱导条件进一步扩大培养。接种含有200 μL AspN/pET32a重组质粒的BL21菌接种至含Amp+的200 mL LB培养基中，37℃过夜培养，次日以1∶20扩大培养至OD600为0.6左右时，加入最优浓度的IPTG，最优的诱导温度和时间。收集菌体，8 000 r/min，4℃离心，10 min，弃上清，得到的菌体沉淀。按质量体积比1∶10用1×PBS进行菌体悬浮。将混液置于冰上超声破碎（功率360 W，超声2 s，间歇5 s，共40 min）。然后11 000 r/min，4℃离心，30 min，分别收集上清和沉淀。上清用0.45 μm滤膜过滤后，通过镍金属螯合层析纯化获得带有Trx标签的融合蛋白。平衡缓冲液为20 mmol/L PB，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑（pH7.4）；洗脱液为20 mmol/L PB，0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L 咪唑（pH7.4），采用阶梯的洗脱方式进行纯化。目的融合蛋白由于Trx的存在，具有一定的酶活性抑制作用，在洗脱的缓冲液中，不会发生自切的现象。故最终得到的为重组内肽酶AspN-Trx。该融合蛋白可经凝胶过滤层析G25脱盐柱将酶置换到最佳反应缓冲液（50 mmol/L Tris，2.5 mmol/L ZnSO4，pH8.0）中发生自切，自动切除Trx融合标签而激活成完全活性的成熟酶。

1.2.5 HPLC检测重组内肽酶AspN的活性 空白组为重组内肽酶AspN-Trx与组蛋白按1∶100混合后加甲酸立即终止反应的样品；试验组为重组内肽酶AspN-Trx与组蛋白按1∶100混合加入缓冲液（50 mmol/L Tris，2.5 mmol/L ZnSO4，pH8.0），37℃反应过夜后样品。将样品离心后，分别取10 μL，用C18柱进行HPLC检测。

1.2.6 SDS-PAGE 检测重组内肽酶AspN的活性空白组为10 μL重组西妥昔单克隆抗体和激活的酶，对照组重组西妥昔单克隆抗体与酶混合后甲酸立即终止反应。试验组重组酶和重组西妥昔单克隆抗体按1∶10加入到缓冲液（50 mmol/L Tris，2.5 mmol/L ZnSO4，pH8.0），37℃反应过夜。分别取各样品10 μL，加入到含有8 μL 2×loading buffer 2 μL 1 mol/L DTT的上样缓冲液中，95℃加热5 min后，将20 μL样品全部上样，进行12%SDS-PAGE检测。

1.2.7 荧光试验检测重组内肽酶AspN的活性 取1 mg荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe（NO2）-Tyr-Asp加入到1 mL的超纯水中，完全溶解。取1 μL（约1 μmol）的荧光底物加入到含有不同酶量的内肽酶AspN的150 μL缓冲液（50 mmol/L Tris，2.5 mmol/L ZnSO4，pH8.0）中，37℃反应，用330 nm的激发光，450 nm的发射光，荧光酶标仪检测荧光量。

2 结果

2.1 目的基因的获取

由Invitrogen公司合成，共1 086个核甘酸序列如下：

2.2 表达载体的构建

构建的重组表达载体用BamH I和Xho I做双酶切鉴定，获得大小5 900 bp的线性pET32a表达载体和大小约1 000 bp的目的基因条带（图1）。结果表明成功构建重组质粒AspN/pET32a。

图1 重组质粒AspN/pET32a 的BamHI与XhoI双酶切鉴定

2.3 融合蛋白的诱导表达

构建正确的质粒AspN/pET32a转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株，通过IPTG诱导表达出与预期目的蛋白大小一致的重组蛋白，大小为57 kD。此融合蛋白以可溶性及包涵体的形式同时存在。由于包涵体复性过程复杂，并且复性得率不高，故继续研究可溶性表达。为了避免重组酶发生自切，选择低温16℃；IPTG浓度影响不大，选择常规0.1 mmol/L；避免诱导时间过长蛋白发生降解，选择诱导6 h。最终确定在0.1 mmol/L IPTG，16℃，6 h的条件下获得可溶的目的蛋白（图2）。

图2 不同IPTG浓度AspN/pET32a的表达分析

2.4 融合蛋白的纯化

SDS-PAGE检测结果（图3）显示，在30%洗脱液（20 mmol/L PB，0.5 mol/L NaCl，150 mmol/L咪唑）的条件下得到目的蛋白。

经诱导表达后的4.8 L的菌液经亲和层析和脱盐的后得到4.5 mg，纯度为90%左右的成熟内肽酶AspN（图4）。重组内肽酶AspN纯化过程中的得率和纯化步骤，见表1。

2.5 HPLC检测重组内肽酶AspN的活性

通过重组内肽酶AspN酶切组蛋白鉴定其活性。空白组重组酶AspN-Trx与组蛋白混合后立即终止反应，组蛋白特定的峰存在，而试验组AspN-Trx与组蛋白37℃反应过夜后组蛋白内部的天冬氨酸N端的肽键被切断，特定的组蛋白片段被切碎消失，如箭头所标示（图5），说明重组内肽酶AspN-Trx经缓冲液自激活后具有较好的酶切活性。

2.6 SDS-PAG检测重组内肽酶AspN的活性

通过重组内肽酶AspN切抗体鉴定其活性。重组酶与重组西妥昔单克隆抗体反应，检测抗体特异的片段消失（图6）说明重组内肽酶AspN有较好的酶切活性。

图3 重组内肽酶AspN-Trx镍金属螯合层析柱纯化图（A）和SDS-PAGE分析（B）

图4 重组内肽酶AspN-Trx凝胶过滤层析切除标签纯化图（A）和SDS-PAGE分析（B）

表1 重组内肽酶AspN纯化过程的得率和纯化

图5 HPLC验证重组内肽酶AspN-Trx酶切活性

2.7 荧光试验检测重组内肽酶AspN的活性

用荧光底物检测蛋白的活性，底物浓度为饱和状态，通过反应速率来衡量酶的活性（图7）。重组内肽酶AspN-Trx与标准品内肽酶AspN具有基本一致的酶切活性。

3 讨论

随着内肽酶AspN在生物和医药领域的广泛应用，通过宿主菌进行表达提取的方式越来越成为瓶颈，开发重组表达工艺进行高效率低成本的制备越发显得必要。在本研究首次原核可溶性表达重组内肽酶AspN，简单的纯化步骤即获得了纯度高活性好的内肽酶AspN，其为进一步进行该酶晶体结构研究和活性作用机制研究奠定了基础。

图6 重组内肽酶Asp酶活检测的SDS-PAGE图

图7 重组内肽酶AspN-Trx与标准内肽酶AspN的荧光试验测活曲线

具有酶切活性的重组AspN通过Trx融合表达的方式来进行可溶性表达，其Trx既可以作为纯化标签及易于蛋白空间结构形成进行可溶性高效表达，同时也可以在一定程度上对该酶的活性进行抑制，从而减少可溶性表达酶活高，对宿主菌造成毒性反应。同时本研究也在诱导蛋白表达、收集菌体、超声破碎菌体、离心获得可溶表达的上清的过程中采用低温条件，提高蛋白的稳定性，并有效抑制酶的活性。在诱导过程中，IPTG浓度对总蛋白的表达量有一定影响，从0.01 mmol/L到0.1 mmol/L总蛋白表达条带依次增高，0.1 mmol/L到0.2 mmol/L时增加不明显，虽然从蛋白表达条带上看，增加的主要是不溶性包涵体，最终选择采用了0.1 mmol/L的诱导条件；由于该酶采用融合表达的方式，其融合标签抑制了酶的活性，所以在融合蛋白表达过程中优先考虑适宜菌生长的37℃，有利于菌的繁殖获得更多的目的蛋白，然而对于其它类型的活性酶来说要避开酶的最适温度以免发生自切或是对宿主菌造成危害；在诱导表达的时间的选择上，一般不宜过长，时间长菌的代谢物积累，一些宿主菌内源性酶也会导致一些目的蛋白的降解，不利于目的蛋白的表达。在纯化过程中，可采用分步洗脱多种方式，从而有效的得到较高浓度和纯度的目的蛋白。

重组内肽酶AspN-Trx在酶切缓冲液中发挥自激活后具有较高的酶切活性，经过荧光底物活性检测，该酶具有和对照提取酶基本一致的活性，由于天然酶在革兰氏阴性菌脑膜毒性黄杆菌分泌表达中含有O-连接的糖基化位点修饰，大肠杆菌重组表达时缺少这种翻译后修饰，而它们的活性差别不是太大，也就说明该O-糖基化修饰可能对酶的活性影响不大。若将该重组酶和天然酶进行晶体结构的解析将进一步探索该糖基化修饰对该酶的空间结构影响以及酶活中心和与底物的作用机制。

大肠杆菌表达外源蛋白具有产量高的优点，加上纯化标签可以快速得到目的蛋白，同时利用HPLC、SDS-PAGE和荧光试验检测蛋白的活性具有快捷方便的特点。利用基因工程的手段，合理的试验技术能够快速、有效的得到有活性的蛋白酶，该酶的重组表达也为其它活性酶的重组表达提供了一个很好的范本。

4 结论

本研究首次利用基因工程技术在大肠杆菌里重组可溶性融合表达内肽酶AspN，该重组酶AspN/ pET32a具有高表达的同时，还可以通过亲和层析对该酶进行快速地纯化。运用荧光试验对酶进行定量分析，重组内肽酶具有与提取内肽酶基本一致的酶切活性。

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（责任编辑 李楠）

Cloning，Expression，Purification and Characterization of Soluble Recombinant Endoproteainase AspN

Zheng Juan1，2Guo Huaizu2，3Li Jing2，3Duan Shuyan1，2Zhao Ziye1，2Zhang Dapeng2，3Guo Shangjing1Wang Hao2，3
（1. School of Pharmacy of Liaocheng University，Liaocheng 252000；2. State Key Laboratory of Antibody Medicine and Targeted Therapy，Shanghai 201203；3. Second Military Medical University，Shanghai 200433）

Endoproteinase AspN（flavastacin）is a zinc metalloendopeptidase which can selectively cleave peptide bonds N-terminal to aspartic acid residues， also it is one of most widely used proteolytic enzyme used for protein digestion prior to MS or HPLC analysis. The natural endoproteinase AspN was extract from the bacteria， Elizabethkingia meningoseptica. Some factors including low yields， difficulty in purification and high cost， greatly limit the application of the enzyme. Target gene was cloned into an pET32a expression vector and transformed into E.coli BL21（DE3）. This is the first report for the soluble expression of AspN-Trx in prokaryotic expression system and a poly-histidine tag enabled purification by Ni affinity chromatography. The activity of the recombinant endopeptidase AspN was identified by HPLC， SDS-PAGE and the fluorogenic substrate Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe（NO2）-Tyr-Asp. The results showed that the recombinant endopeptidase AspN was consistent with the standard enzyme and can be used widely.

recombinant endoproteinase AspN；prokaryotic expression；purification；activity assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.028

2014-07-04

郑娟，女，研究生，研究方向：分子细胞生物学；E-mail：zhengjuan2006400741@126.com

郭尚敬，男，教授，硕士生导师，研究方向：基因工程药物；E-mail：guoshangjing@lcu.edu.cn王皓，男，研究员，博士生导师，研究方向：基因工程抗体；E-mail：hwang_summu@163.com