八角叶多糖的最佳提取工艺研究

邹修文，杨啟源，盛家荣

(广西师范学院化学与材料科学学院，广西 南宁 530001)

八角是我国珍贵经济树种，在我国南方地区具有悠久的栽培和应用历史，广西是中国乃至全球最大的八角主产区，其品质优良，被称为“世界八角之乡”[1]。八角又称“八角茴香”，含丰富的天然活性成分八角茴香油﹑有机酸﹑八角茴香油树脂﹑黄酮﹑倍半萜内酯﹑多糖﹑木脂素类等[2]。八角的研究已成为近年来的研究热点[3-10]，八角果﹑茎﹑叶中均含有多糖[11-13]，但关于八角叶多糖的最佳提取工艺研究尚未见报道。做好八角的研究开发，增加八角的高附加值，对广西经济发展具有重要意义。本文以粗多糖提取率为考察指标，采用水提醇沉法提取八角叶多糖，通过正交设计实验优化影响粗多糖产率的主要因素，为八角叶多糖的深入研究与开发利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 原料、试剂及仪器

原料：八角叶采自广西壮族自治区北流市西埌镇大车村；试剂：D-葡萄糖（化学纯），无水乙醇﹑丙酮﹑苯酚﹑硫酸（均为分析纯）。

仪器：DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱，ME203E 型电子天平，HH-4 型数显恒温水浴锅，RV 10 basic 型旋转蒸发仪，SHB-B95 型循环水式多用真空泵，DT5-2 型低速台式离心机，722S 型可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验设计

设计L9(34)正交表[14]，选择提取时间﹑料液比﹑提取温度和提取次数4 个因素设计正交实验，因素水平表见表1。

表1 八角叶多糖提取因素水平

1.2.2 八角叶多糖的提取

将八角叶清洗干净﹑烘干﹑粉碎 ，准确称取9 份八角叶干粉，每份12.000g，按正交实验表下的因素水平条件进行实验。水煮至规定时间后，放冷，离心（4000r·min-1×3min），取上清液，减压浓缩至20mL，加4 倍体积无水乙醇沉淀多糖，置于冰箱中静置过夜，抽滤，分别用无水乙醇﹑丙酮洗涤2～3 次，60℃下烘干，得固体粉末，称重，计算粗多糖提取率。1.2.3 苯酚-硫酸法测定多糖[13]

1）标准溶液的配制：准确量取苯酚5.000g，用适量蒸馏水溶解，转移至100mL 棕色容量瓶，稀释至刻度，即得5.0%苯酚溶液。准确称取干燥恒重的葡萄糖0.025g，加适量蒸馏水溶解，转移至250mL容量瓶，稀释至刻度，即得100μg·mL-1葡萄糖标准溶液。准确量取100μg·mL-1葡萄糖标准溶液5.0﹑10.0﹑15.0﹑20.0﹑25.0﹑30.0﹑35.0mL 于7 个50mL容量瓶中，稀释至刻度，即得10﹑20﹑30﹑40﹑50﹑60﹑70μg·mL-17 个不同浓度对照品系列溶液。

2）标准曲线的绘制：准确移取7 个不同浓度对照品系列溶液1.0mL 于20mL 干燥具塞试管，分别加入1.0mL 5%苯酚溶液，冰水浴条件下再分别加入5.0mL 浓硫酸，摇匀，沸水浴加热25min，稍冷却，冰水浴条件下再加入10mL 蒸馏水，待冷却至室温，用722S 型可见分光光度计在484nm 处测定其吸光度A。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并建立回归分析方程。

3）多糖含量的测定：准确称取八角叶粗多糖0.011g 于50mL 烧杯，加入1mol·L-1H2SO42 mL，加热水解2h，冷却至室温，转移至100mL 容量瓶，稀释至刻度，即得样品液。准确量取1.0mL 样品液3 份置于20mL 干净具塞试管，分别加入1.0mL 5.0%苯酚溶液，冰水浴条件下再分别加入5.0mL 浓硫酸，摇匀，沸水浴加热25min，稍冷却，冰水浴条件下再加入10mL 蒸馏水，待冷却至室温，用722S 型可见分光光度计在490nm 处测定其吸光度A。根据测定结果和回归分析方程，计算八角叶中多糖的含量。

2 结果与分析

2.1 正交实验

以L9(34)正交表进行实验，选择提取时间﹑料液比﹑提取温度和提取次数等4 个主要影响因素设计正交实验，实验结果见表2。从表2 极值R 可以看出4 个因素对粗多糖提取率影响的主次顺序是D＞A ＞B ＞C，即主要影响因素是提取次数，其次是提取温度﹑料液比﹑提取时间，并得出该正交实验的最佳组合为D2A3B3C2，即提取次数为2 次，提取温度为75℃，料液比为1∶50，提取时间为3h。

2.2 验证实验

按照最佳工艺条件进行3 批验证实验，粗多糖提取率分别为13.08%，12.63%，12.89%，其平均值为12.87%，验证结果比较稳定，与正交设计实验最优实验结果接近。

2.3 标准曲线的建立

根据1.2.3 所测得的葡萄糖对照品系列浓度的吸光度（表3），对表3 的数据用计算机进行线性回归分析，得到回归方程：A=0.06229+0.00864C，R=0.99837，标准曲线见图1。

表2 正交实验结果

表3 葡萄糖对照品系列浓度的吸光度结果

图1 葡萄糖对照品系列浓度的吸光度数据线性回归分析

2.4 多糖含量的测定

最佳工艺条件下，八角叶粗多糖提取率为12.87%，根据1.2.3 所测得的八角叶粗多糖样品的吸光度结果见表4。根据2.3 建立的标准曲线的回归方程及以下公式计算八角叶粗多糖中多糖的含量[15]：

其中：W样为八角叶粗多糖中多糖的含量，%；100 为所配成样品溶液的体积；C样为由回归方程计算得到的样品浓度，μg·mL-1；0.91 为多糖的校正系数[16]；106为单位转换因子；m样为配成样品溶液称取的粗多糖样品质量。

根据所测得样品吸光度，代入回归方程计算得出样品浓度，进而代入以上公式，计算得出八角叶干粉中多糖的含量，结果列于表4。

表4 样品的吸光度及多糖含量结果

3 结论

采用正交设计实验优化了水提醇沉法提取八角叶粗多糖的工艺条件，提取八角叶粗多糖的最佳工艺条件为：提取次数为2 次，提取温度为75℃，料液比为1∶50，提取时间为3h。在最佳工艺条件下，八角叶粗多糖提取率为12.87%，其多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，粗多糖中多糖含量为28.22%。八角叶多糖中还含有蛋白质﹑小分子杂质等物质，需要进一步进行脱蛋白﹑除小分子杂质及过柱等才能得到较纯的单一组分，这些还有待于进一步深入研究。

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