方格星虫体腔液多糖的提取及体外抗氧化活性

董兰芳，张琴，童潼，许明珠

（广西壮族自治区海洋研究所，广西海洋生物技术重点实验室，广西北海536000）

方格星虫体腔液多糖的提取及体外抗氧化活性

董兰芳，张琴*，童潼，许明珠

（广西壮族自治区海洋研究所，广西海洋生物技术重点实验室，广西北海536000）

该试验分别从浓缩温度和碱加入量两个方面初步研究了方格星虫体腔液多糖的提取条件，得到最佳浓缩温度为70℃，NaOH最佳加入量为质量体积百分比1%，该条件下多糖提取率为0.75 g/L，多糖含量为51.39%。将最佳提取条件下所得多糖进行体外抗氧化活性研究，结果表明：在该研究设定的浓度范围内，方格星虫体腔液多糖具有较高的还原能力，对羟自由基和超氧自由基也有一定的清除能力，1 mg/mL时清除率分别为76.88%和26.17%，但还原能力和自由基清除能力均弱于抗坏血酸。

方格星虫；体腔液；多糖；提取；抗氧化活性

方格星虫（Sipunculus nudus），俗称“沙虫”，隶属星虫动物门方格星虫纲方格星虫属，为世界广布性种类，我国沿海从南到北均有分布。近年来随着海洋药物的开发及糖类药物的研究进展，人们发现方格星虫多糖具有抗病毒、抗辐射、抗疲劳、提高记忆力等生物学功能［1-4］。方格星虫体腔液是一个复杂的内环境系统，含有多种离子、酶类、抗菌素、色素、细胞毒素、嘌呤化合物及一些代谢产物［5］。在实际生产生活中，方格星虫体腔液是被丢弃的低值部分，不仅造成资源浪费，对环境也产生了污染。目前，国内外对方格星虫体腔液功能性成分的研究鲜见报道［6］，该试验研究了方格星虫体腔液多糖的提取方法及其体外抗氧化活性，为进一步筛选海洋动物活性多糖及开发海洋多糖药物提供理论参考，对于增加方格星虫的经济附加值有重要的意义。

1材料与方法

1.1试剂与材料

试验用方格星虫：购于北海市南珠市场；仪器设备：溶剂蒸发工作站（Genevac EZ-2，英国），高速冷冻离心机（Thermo KR25i，美国），冷冻干燥机（Coolsafe 1104L，丹麦），紫外可见分光光度计（UV6300，上海）；主要试剂：抗坏血酸，乙醇，三氯甲烷，正丁醇，三氯乙酸，苯酚，葡萄糖，氢氧化钠、邻苯三酚、双氧水、硫酸亚铁等，均为分析纯。

1.2方格星虫体腔液多糖的提取

方格星虫用纯水洗净，沥干水分，用剪刀剖开，收集体腔液。体腔液于溶剂蒸发工作站，分别设定温度50、60、70℃进行浓缩，至体积为原来的1/5左右，sevag法去蛋白3次，用截留相对分子量为100 000以上的玻璃纸透析24 h，3 000 r/min离心除去不溶物，上清液加乙醇至终浓度为70%，4℃沉淀过夜，9 000 r/min离心10 min，沉淀冷冻干燥即方格星虫体腔液多糖，以提取率和多糖含量为指标确定最佳浓缩温度。体腔液加入NaOH至终质量体积百分比分别为1%、2%、3%，用最佳浓缩温度重复提取操作，确定最佳碱加入量。多糖提取率=m/v。式中：m为粗多糖质量，g；v为提取所用方格星虫体腔液体积，L。

1.3多糖含量测定

多糖含量采用苯酚-硫酸法［7］测定。

1.4多糖抗氧化活性的测定

1.4.1总还原力测定

多糖样品、pH 6.6 0.2 mol/L磷酸缓冲液和1% K3Fe（CN）6溶液各取1.0 mL混合，50℃水浴20 min，冰水冷却后加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀。3 000 r/min离心10 min后取上清1.0 mL，依次加入1.0 mL蒸馏水、0.2 mL 0.1%FeC13溶液，混匀，静置10 min。蒸馏水做参比，于700 nm处测定吸光度。实验均重复操作3次，结果取平均值。

1.4.2羟自由基清除率

羟基自由基测定采用Smimoff法测定［8］，配制一定浓度的多糖溶液以及浓度为8.0 mmol/L的H2O2，8.0 mmol/L的FeSO4和8.0mmol/L的水杨酸-乙醇溶液备用。取上述FeSO4、水杨酸乙醇溶液各1.0 mL于试管中，分别加入不同浓度的多糖溶液和1.0mL8.0mmol/LH2O2各1.0 mL，摇匀，37℃水浴30 min，以蒸馏水做参比，于510 nm处测其吸光度值。实验均重复操作3次，结果取平均值。清除率（%）=（A空白-A样品）/A空白×100%

1.4.3超氧自由基抑制率

超氧自由基测定采用改良的邻苯三酚自氧化法［9-10］，取50mmol/LTris-HC1缓冲液4.5mL（pH=8.2）和4.2mL蒸馏水混匀后在25℃水浴中保温20 min，取出后分别加入不同浓度的多糖溶液1 mL和25 mmol/L邻苯三酚0.4 mL（空白管用8 mmol/L HC1代替邻苯三酚溶液）。充分混匀后，于25℃水浴锅中准确反应5 min后（加入邻苯三酚时开始计时），立即加入8 mmol/L HCl溶液终止反应，在320 nm处测定吸光度。实验均重复操作3次，结果取平均值。抑制率（%）=（A空白-A样品）/ A空白×100%

1.5数据处理

采用SPSS 13.0 for Windows对所得数据进行方差分析，若差异达到显著，则进行Tukey多重比较，显著性水平为P＜0.05。

2结果与分析

2.1方格星虫体腔液多糖的提取

2.1.1浓缩温度对多糖提取率和多糖含量的影响

该研究优化了多糖提取的浓缩温度，浓缩温度对多糖提取率和多糖含量的影响结果见表1。

表1　浓缩温度对多糖的提取率及多糖含量的影响Table 1Effect of concentration temperature on polysaccharide yield and content

随着浓缩温度的升高，多糖含量大幅度提高，70℃达31.74%；50℃浓缩提取率虽较高，但多糖含量很低，70℃提取率最高，为1.03%。温度越高越有利于胞内物质的浸出，因此方格星虫体腔液多糖的最佳浓缩温度为70℃。

2.1.2碱加入量对多糖提取率和多糖含量的影响

动物中所含的多糖多是酸性多糖，常与蛋白质牢固地结合在一起，目前常用碱液提取法和蛋白酶水解法提取分离［11］。该研究提取多糖时对碱加入量进行了优化，结果见表2。

表2　碱加入量对多糖的提取率及多糖含量的影响Table 2Effect of the amount of alkali on polysaccharide yield and content

随着NaOH百分比的增加，多糖含量增加，多糖提取率却大大降低。碱液提取法基于蛋白多糖中的糖肽键对碱的不稳定性，提取过程应在较温和条件下，以避免氨基多糖的降解［12］，因此碱加入量增加，浓缩后碱浓度成倍增长，使碱浓度过高，造成多糖降解，因而提取率降低。综合比较对多糖含量和多糖提取率的影响，选择NaOH质量体积百分比1%为最佳碱加入量。

2.2方格星虫体腔液多糖的抗氧化活性

2.2.1方格星虫体腔液多糖的体外还原力

方格星虫体腔液多糖的体外还原力结果见图1。

图1　方格星虫体腔液多糖的还原能力Fig.1Reducing power of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid at the indicated concentrations

反应体系中，还原物质与K3［Fe（CN）6］反应生成K4［Fe（CN）6］，再与Fe3+反应生成普鲁士兰，在700 nm处有特异吸收，吸光值越大还原能力越强［13］。由图1可知，在试验浓度范围内，方格星虫体腔液多糖的还原能力与多糖浓度成正相关，低于相同浓度抗坏血酸的还原能力。试验结果表明，方格星虫体腔液多糖具有一定的还原能力，强于鲍鱼脏器多糖（FAVP和 MAVP）和乌贼墨多糖［13-14］，但比抗坏血酸弱。

2.2.2方格星虫体腔液多糖对羟自由基的清除能力

方格星虫体腔液多糖对羟自由基的清除能力结果见图2。

图2　方格星虫体腔液多糖对羟自由基的清除能力Fig.2Hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid

羟自由基被认为是毒性最强的活性氧自由基，极易造成机体过氧损伤，生物体内羟自由基的含量与其衰老、肿瘤辐射损伤和细胞吞噬等具有一定的相关性［15］。该研究考察了方格星虫体腔液多糖清除羟自由基的能力，结果见图2。随着多糖浓度的增加，多糖对羟自由基的清除能力逐渐增强，在多糖浓度为1 mg/mL时清除率达到76.88%，清除能力较海参脏器多糖HPS1和HPS2高（1 mg/mL时分别为52.76%和64.66%）［16］，比抗坏血酸稍低。试验结果表明，方格星虫体腔液多糖对羟自由基的清除呈剂量依赖性，提示方格星虫体腔液多糖可能是一种较好的羟自由基清除剂。

2.2.3方格星虫体腔液多糖对超氧自由基的抑制能力

方格星虫体腔液多糖对超氧自由基的抑制能力结果见图3。

图3　方格星虫体腔液多糖对超氧自由基的抑制能力Fig.3Superoxide anion scavenging effect of polysaccharide from S.nudus coelomic fluid

超氧自由基不仅自身具毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。由图3可看出，试验浓度范围内，随着浓度的增加，方格星虫体腔液多糖对超氧自由基的抑制作用先是增加较快随后有所减缓，这可能是在较高浓度条件下多糖自身的溶解性限制了对超氧自由基的抑制能力。较高浓度的方格星虫体腔液多糖对超氧自由基的抑制能力远远低于相同浓度的抗坏血酸，1 mg/mL时多糖和抗坏血酸的抑制率分别为26.17%和89.72%，多糖的抑制能力低于海参脏器多糖（HPS1和HPS2）［16］及海星多糖［17］。

3结论

该试验的研究表明浓缩温度70℃、NaOH质量体积百分比1%时，较适宜方格星虫体腔液多糖的提取，提取率为0.75 g/L，多糖含量为51.39%。抗氧化试验表明：在体外环境中，方格星虫体腔液多糖有较好的还原能力和羟自由基清除力，对超氧自由基也有一定的抑制能力。因此，方格星虫体腔液多糖具有良好的开发应用前景，同时对于增加方格星虫的经济附加值有重要意义。

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Extraction and Antioxidant Activity in Vitro of Polysaccharide from Sipunculus Nudus Coelomic Fluid

DONG Lan-fang，ZHANG Qin*，TONG Tong，XU Ming-zhu
（Guangxi Institute of Oceanology，Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi，Beihai 536000，Guangxi，China）

In this paper，concentrated temperature and the amount of alkali were optimized for extraction conditions of polysaccharide from sipunculus nudus coelomic fluid.The optimal concentrated temperature was 70℃，and the amount of NaOH was 1%（mass to volume ratio）.Under this condition，yield of polysaccharide was 0.75 g/L，and polysaccharide content was 51.39%.The antioxidant activity of polysaccharide obtained under optimum condition was studied in vitro.The results showed that in the indicated concentrations，the polysaccharide possessed strong reducing power，and scavenged hydroxy radical and superoxide radical to a certain extent，the clearance rates were 76.88%and 26.17%respectively at 1 mg/mL.But the reducing capacity and free radical scavenging activity were weaker than ascorbic acid.

sipunculus nudus；coelomic fluid；polysaccharide；extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.011

2013-09-30

董兰芳（1987—），女（汉），助理研究员，本科，研究方向：水产动物天然产物开发的研究。

张琴（1982—），女，博士，副研究员，主要从事水产动物天然产物开发的研究。