响应面分析法优化超声提取兰坪被毛孢多糖和D-甘露醇

杜亚茜，虞 泓，葛 锋，*，刘迪秋，陈朝银

（1.昆明理工大学，生命科学与技术学院，云南昆明650500；2.云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南昆明650091）

响应面分析法优化超声提取兰坪被毛孢多糖和D-甘露醇

杜亚茜1，虞 泓2，葛 锋1，*，刘迪秋1，陈朝银1

（1.昆明理工大学，生命科学与技术学院，云南昆明650500；2.云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南昆明650091）

以兰坪虫草无性型（兰坪被毛孢）固体发酵产物为材料，以水为提取溶剂，在常温条件下利用响应面分析法优化虫草多糖和D-甘露醇的超声提取综合工艺。在超声常温水提的单因素实验的基础上，运用响应面法进一步考察液固比、超声时间、超声功率对虫草多糖和D-甘露醇综合提取率的影响，以优化提取工艺。实验得到较优综合提取工艺条件为：液固比43∶1mL/g，超声时间为50min，超声功率为56W。在该工艺条件下虫草多糖提取率为23.06%，D-甘露醇提取率为2.30%。

兰坪虫草，兰坪被毛孢，响应面法，超声提取

兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis H.Yu& Z.H.Chen）主要分布于滇西北地区，是寄生于钩蝠蛾和剑川钩蝠蛾的一种虫草菌，属于线虫草属，与冬虫夏草亲缘关系较近，而且有效成分的种类和含量与冬虫夏草相似，开发研究兰坪虫草这对缓解冬虫夏草资源短缺问题具有重要价值［1-2］。兰坪虫草中含有虫草多糖、D-甘露醇等多种活性成分。研究［3-4］表明虫草多糖具有调节免疫、抗肿瘤、护肾、延缓衰老、提高免疫力，降血糖、血压、血脂，保护心脏等多种功效。D-甘露醇可应用于由不同原因引起的脑水肿、治疗颅脑疾患、顽固心绞痛、消化系统疾病、急性脑梗塞、顽固性腹水等［5-6］。

现阶段，对中药材有效成分的提取方法包括：微波辅助提取、索氏提取、超声提取等［7-8］，其中微波辅助提取与索氏提取会遇到温度难控或提取温度过高等问题，这会使有效成分提取不完全或导致有效成分分解，原料利用率不高，导致中药材资源的浪费。因此研究中药材活性成分在常温下的综合提取工艺具有重要的应用价值，本文是采用低温超声提取多组分的工艺优化研究。

响应面分析法是优化工艺条件的一种有效方法，可以确定一个或若干个变量与测试成分之间的关系，识别实验的影响因子及其交互过程的响应，准确地反应因素之间的关系及响应值［9-12］。本文以兰坪虫草无性型［13］兰坪被毛孢（Hirsutella lanpingensis H. Yu&Z.H.Chen）固体发酵产物为材料，以水为提取溶剂，在常温条件下利用响应面分析法优化虫草多糖和D-甘露醇的超声提取的综合工艺方面做了一定的研究，为兰坪虫草的开发利用提供了理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兰坪被毛孢 云南云百草生物技术有限公司［13］，本文采用固体发酵培养兰坪被毛孢菌丝体［1］；苯酚、乙酸铵 天津市风船化学试剂科技有限公司（分析纯）；浓硫酸、浓盐酸 重庆川东化工有限公司（分析纯）；高碘酸钾 天津市光复精细化工研究所（分析纯）；L-鼠李糖 Sigma；乙酰丙酮 Adamas Reagent Co.；实验用水 为去离子水。

XO-SM 100超声微波组合反应装置 南京先欧仪器制造有限公司；HH-S水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；Ultrospec 2100pro紫外分光光度计Amersham Biosciences；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖与D-甘露醇测定方法及提取率计算公式

虫草多糖含量的测定［14-15］：取约2m L适当稀释的样品与1m L 5%苯酚溶液，混匀后加入7m L浓硫酸混匀。将混合物置于40℃水浴锅中水浴30m in后，迅速冷却至室温。空白对照以1m L的蒸馏水代替样品，用紫外可见分光光度计在490nm波长下测定吸光度。实验重复3次，取平均值带入多糖标准曲线方程计算多糖含量。

D-甘露醇含量的测定［16-17］：取约1m L适当稀释的样品与1m L高碘酸钾溶液混合，在室温中静置10m in，加入2m L的1%L-鼠李糖溶液，混匀。加入4m L新鲜配制的NASH试剂（7.5g乙酸铵、100μL冰醋酸和100μL乙酰丙酮，用蒸馏水定容50m L）剧烈摇匀。将混合物置于53℃水浴锅中水浴15m in后，迅速冷却至室温。空白对照用蒸馏水代替样品，用紫外可见分光光度计在412nm波长下测定吸光度。实验重复3次，取平均值带入D-甘露醇标准曲线方程计算D-甘露醇含量。

提取率计算公式：

式中，Xi为多糖/D-甘露醇含量（mg）；X为样品干重（g）；Yi为多糖/D-甘露醇提取率。

1.2.2 超声提取单因素实验 固定超声时间30m in、超声功率30W的条件，考察液固比分别为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1m L/g时对兰坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影响；固定液固比40∶1m L/g、超声时间30m in的条件，考察超声功率分别为10、30、50、70、90、110、130W时对兰坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影响；固定液固比40∶1m L/g、超声功率30W的条件，考察超声时间分别为10、20、30、40、50、60、70m in时对兰坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影响；固定液固比40∶1m L/g、超声时间30min、超声功率30W的条件，考察浸泡时间分别为0、2、4、6、8、10h时对兰坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影响。

1.2.3 响应面法实验设计 在单因素实验的基础上，固定浸泡时间为8h，选择对多糖和D-甘露醇提取率响应值有显著影响的因素及水平，使用Box-Behnken设计方案，分别以液固比、超声时间和超声功率为三个独立变量A、B、C，以-1、0、1代表各变量水平，对自变量进行编码（表1）。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Levels and codes of variable chose forBox-Behnken design

1.2.4 数据处理 采用Design Expert 8.0.6软件分析。

2 结果与分析

2.1 超声提取单因素实验

2.1.1 液固比对多糖和D-甘露醇提取率的影响 由图1可知，多糖和D-甘露醇的提取率随液固比升高而升高，都在35∶1m L/g之后趋于平稳，原因可能是随着液固比的增加，多糖和D-甘露醇的溶解量增加，使两种成分的提取率升高。

图1 液固比对兰坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.1.2 超声功率对多糖和D-甘露醇提取率的影响由图2可知，多糖和D-甘露醇的提取率随超声功率的提高呈现先升高后降低的趋势，均在超声功率为50W时提取率较高，原因可能是超声功率的过度提高会产生一定的空化效应或化学效应，导致两成分的破坏，从而降低提取率。

2.1.3 超声时间对多糖和D-甘露醇提取率的影响由图3可知，多糖的提取率随超声时间的升高而升高，在50m in后趋于平稳，而D-甘露醇在超声时间为40m in后趋于平稳，原因可能是多糖成分含量较高，在延长超声时间时能更充分的提取到溶剂中，而D-甘露醇含量较低，40m in左右的超声时间就可以提取较完全。

图2 超声功率对兰坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

图3 超声时间对兰坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.1.4 浸泡时间对多糖和D-甘露醇提取率的影响由图4可知，多糖和D-甘露醇的提取率随浸泡时间升高而升高，在8h之后趋于平稳，原因可能是随着浸泡时间的增加，细胞的吸胀作用增大，使细胞易破裂，从而导致提取率升高。

图4 浸泡时间对兰坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影响Fig.4 Effect of soak period on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.2 响应面实验结果分析

运用Box-Behnken设计方案，多糖和D-甘露醇提取率的测定结果见表2。使用Design Expert 8.0.6软件对表2数据进行拟合分析，得到多糖和D-甘露醇的二次多元回归方程分别为：

多糖=21.9+2.32A+1.68B+0.32C-0.84AB-0.52AC+ 1.05BC-0.66A2-2.75B2-2.98C2

D-甘露醇=2.18+0.28A+0.098B+0.15C+0.096AB+ 0.22AC+0.12BC-0.29A2-0.099B2-0.33C2

表2 Box-Behnken设计及多糖和D-甘露醇提取率的测定值Table 2 Box-Behnken design and the responses of the extraction rate of total polysaccharide and D-mannitol

表3 回归模型的方差分析Table 3 ANOVA analysis for response surface quadraticmodel

对多糖和D-甘露醇的二次多元回归方程进行显著性检验和方差分析结果见表3。表3显示两个模型p值分别为0.0003和0.0035，均小于0.05可说明两模型显著，且两模型失拟项p值分别为0.9031和0.1005均大于0.05为不显著，其相关系数R2分别为0.9656和0.9251，说明两个模型拟合程度较好，模型的调整确定系数R2Adj分别为0.9213和0.8287，说明模型1可解释92.13%的响应值变化，模型2能解释82.87%的响应值变化，利用模型1、2对优化超声综合提取多糖和D-甘露醇工艺进行一定的分析及预测具有一定的可靠性。

模型1回归方程的系数显著性检验如下：一次项A、B、二次项B2、C2的p值均小于0.01达到极显著水平，表明液固比、超声时间对多糖提取率有显著影响；二次项BC的p值小于0.05，表明超声时间与超声功率的交互作用对多糖提取率的影响为显著。

模型2回归方程的系数显著性检验如下：一次项A、二次项A2的p值均小于0.01达到极显著水平，表明液固比对D-甘露醇的提取率有显著影响；一次项C、二次项C2的p值均小于0.05，表明超声功率对D-甘露醇影响显著；二次项AC的p值小于0.05表明液固比与超声功率的交互作用对甘露醇提取率的影响显著。

利用Design Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归拟合，多糖提取率的响应面见图5～图7；D-甘露醇的响应面见图8～图10。

图5中多糖提取率随液固比和超声时间的增大而增大最后趋于平稳，且多糖提取率随液固比的变化大于随超声时间的变化，说明液固比对提取率的影响大于超声时间对提取率的影响；多糖提取率随液固比的升高而升高，当液固比达到40∶1m L/g左右后，提取率随液固比的升高变化不大。

图5 液固比和超声时间影响多糖提取率的响应面Fig.5 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

图6中多糖提取率随超声功率的提高先升高后下降，呈抛物线趋势，随液固比的升高而升高，超声功率和液固比的交互作用，响应值随液固比的变化大于随超声功率的变化，说明液固比对提取率的影响大于超声超声功率对提取率的影响。

图6 液固比和超声功率影响多糖提取率的响应面Fig.6 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

图7中超声时间和超声功率对多糖提取率的影响均成抛物线形，即随超声时间和功率的增大，提取率呈先升高后降低的趋势；超声时间和超声功率的交互作用对多糖提取的影响显著，表现为曲面较陡。

图7 超声时间和超声功率影响多糖提取率的响应面Fig.7 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

图8中D-甘露醇提取率随液固比升高呈先升高后降低的趋势，但随超声时间变化而变化较缓慢，可以说明液固比相对于超声时间对D-甘露醇提取率的影响更为显著。

图8 液固比和超声时间影响D-甘露醇提取率的响应面Fig.8 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of D-mannitol

图9中D-甘露醇提取率分别随液固比和超声功率的增加呈现升高的趋势之后逐渐平缓，且两因素的交互曲面较陡，说明两因素的交互作用显著。

图10可知，超声功率对D-甘露醇提取率影响变化相对较大，超声功率和超声时间的交互作用较为不明显，表现为曲面较缓。

利用Design Expert 8.0.6软件对回归模型进行分析，得到的较优提取工艺条件为：液固比43∶1m L/g，超声时间50m in，超声功率56W。在该工艺条件下虫草多糖提取率的理论值为23.11%，D-甘露醇提取率的理论值为2.36%。

Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides and D-mannitol from Hirsutella lanpingensis by response surface methodology

DU Ya-xi1，YU Hong2，GE Feng1，*，LIU Di-qiu1，CHEN Chao-yin1
（1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Yunnan Herbal Laboratory，Institute of Herb Biotic Resources，Yunnan University，Kunming 650091，China）

The ultrasonic extraction technology of polysaccharides and D-mannitol was optimized by responsesurface methodology at room temperature. The polysaccharides and D-mannitol were extracted by water fromthe solid fermentation culture of Ophiocordyceps lanpingensis anamorph（Hirsutella lanpingensis）. On the basisof single factor ultrasonic extraction in water at room temperature，the effects of ultrasonic time，ratio of liquid tomaterial and ultrasonic power were investigated to extract polysaccharides and D-mannitol，and the technologywas optimized by response surface methodology. The results showed that the optimum technology was asfollows:the liquid-solid ratio 43∶1mL/g，extraction time 50min，and extraction power 56W. Under the conditions，the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol were 23.06％ and 2.30％，respectively.

Ophiocordyceps lanpingensis；Hirsutella lanpingensis；response surface methodology；ultrasonic extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.053

2014－08－14

杜亚茜（1989-），女，硕士研究生，研究方向：应用真菌学。

*通讯作者：葛锋（1979-），男，博士，教授，研究方向：植物代谢工程，生物制药。

国家自然科学基金项目（31260070）。