TritonX-100-硫酸铵双水相体系分离地榆根总黄酮

李学娟，张挺峰

（1.甘肃省中医院，甘肃兰州730050；2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

TritonX-100-硫酸铵双水相体系分离地榆根总黄酮

李学娟1，张挺峰2，*

（1.甘肃省中医院，甘肃兰州730050；2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

目的：研究利用双水相体系萃取地榆根总黄酮提取的最佳工艺条件。方法：探讨了TritonX-100质量分数，硫酸铵质量分数，黄酮粗提液质量分数、NaCl质量分数和pH等因素对总黄酮萃取率的影响，并采用Box-Benhnken实验确定了最佳实验条件。结果：双水相萃取黄酮最佳条件为，确定双水相体系组成15%TritonX-100/15%硫酸铵，黄酮粗提液质量分数12%、NaCl质量分数0.5%、pH6，地榆根总黄酮前萃取率达到80.02%；反萃取的最佳条件：取1.5mL黄酮萃取上相和2mL乙酸丁酯混合，反萃取率为80.03%。结论：采用双水相萃取地榆根总黄酮简单、易行，生产成本低，在中药提取中具有良好应用前景。

地榆根，总黄酮，双水相，反萃取

地榆（Sanguisorba officinalis L.）是蔷薇科（Rosaceae）地榆属植物，在我国主要分布在东北、华北、西北及广西等地。地榆是一种常用中药，其根具有凉血止血，解毒敛疮之功效，用于治疗吐血、血痢、金疮及烧伤等症，为苦寒凉血之常用药［1］。地榆根中含鞣质、皂苷和黄酮类化合物［2-3］。其中黄酮类化合物含量丰富，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎消肿等作用［4］。

地榆黄酮提取方法主要有机溶剂提取［5］、超声辅助提取法［6］和加压提取法［7］。这些提取方法存在提取效率较低或设备要求高、能耗高、成本高缺点。双水相萃取作为一项新的分离技术因其操作简单，条件温和，处理量大，易于连续操作而日益受到重视。在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有3类：聚合物-聚合物双水相系统、聚合物-无机盐双水相系统和表面活性剂-无机盐双水相系统。表面活性剂双水相系统与聚合物双水相系统相比，体系中由表面活性剂形成的胶束为生物分子提供了独立的封闭空间，减小了生物分子聚集沉淀变性的概率［8］。TritonX-100是含聚氧乙烯型功能基团的非离子表面活性剂，相对温和，适宜于天然产物分离。采用TritonX-100-硫酸铵双水相体系提取地榆总黄酮的方法尚未见报道。

本实验建立了TritonX-100-硫酸铵双水相萃取体系，通过单因素实验和Box-Behnken的组合实验，得到了地榆根总黄酮最佳萃取条件；用乙酸丁酯进行反萃取实验，以期为植物中黄酮的分离纯化与开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地榆 购买于张掖市欧式街德生堂；TritonX-100 平均聚合度9.5，购自Sigma公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇 均为分析纯。

PL-203型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；XO-SM5O型超声波-微波反应系统 南京先欧仪器制造有限公司；DKB-501型数显超级恒温水浴锅 扬州市三发电子有限公司；DHG-9101.1型电热恒温鼓风干燥箱、722型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FZ102型植物试样粉碎机 河北黄骅新兴电器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 地榆粗提液的制备 用电子天平准确称取6.0g已粉碎的地榆根粉末，按照1∶10料液比加入50%的乙醇，在325W，超声10m in，将地榆根细胞进行破碎，破碎后的地榆根细胞悬浊液再抽滤2次，即可得到含地榆总黄酮的粗提液，计算粗提液中地榆总黄酮的含量。

1.2.2 标准曲线的绘制 采用NaNO2-A（ lNO3）3比色法［9］测定黄酮含量，在510nm处测吸光值，得到标准曲线方程为：y=1.227x-0.0036（R2=0.990），其中，y为510nm处测吸光值，x为黄酮含量（mg）。

1.2.3 双水相萃取方法 固定体系总质量为10.00g，加入适量的TritonX-100和（NH4）2SO4，充分振荡使成相物质溶解，同时完成了地榆根总黄酮在双水相系统中的分配过程，在一定条件下萃取。此双水相系统静置一定时间，当两相达到相分离，地榆根总黄酮富集于双水相系统的上相中，分别测定相比R和地榆根总黄酮的含量，并计算其分配系数K及萃取率Y，如下式。

R=上相体积（V）t/下相体积（Vb）

K=上相总黄酮浓度（C）t/下相总黄酮浓度（Cb）

1.2.4 TritonX-100-硫酸铵双水相体系的确定

1.2.4.1 硫酸铵质量分数对双水相体系的影响 在TritonX-100-（NH4）2SO4双水相体系中，TritonX-100质量分数20%不变，分别选取10%、12.5%、15%、17.5%、20%（NH4）2SO4组成双水相，加入质量分数为10%黄酮粗提液，在室温（25℃）条件混合均匀，静止分相后对上下相溶液进行分析，考察硫酸铵质量分数对双水相体系的影响。

1.2.4.2 TritonX-100质量分数对双水相体系的影响

在TritonX-100-（NH）42SO4双水相体系中，（NH）42SO4质量分数15%不变，分别选取10%、12.5%、15%、17.5%、 20%TritonX-100组成双水相，加入质量分数为10%黄酮粗提液，在室温（25℃）条件混合均匀，静止分相后对上下相溶液进行分析，考察TritonX-100质量分数对双水相体系的影响。

1.2.5 影响地榆根总黄酮萃取的因素

1.2.5.1 黄酮粗提液质量分数对双水相体系的影响在15%TritonX-100-15%（NH4）2SO4组成的双水相体系中，分别选取粗提液质量分数为8%、10%、12%、14%、16%，在室温（25℃）条件混合均匀，静止分相后对上下相溶液进行分析，考察粗提液质量分数对双水相体系的影响。

1.2.5.2 NaCl质量分数对双水相体系的影响 在15% TritonX-100和15%（NH4）2SO4组成的双水相体系中，粗提液质量分数为12%不变，分别选取NaCl质量分数为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，在室温（25℃）条件下，对上下相溶液进行分析，考察NaCl质量分数对双水相体系的影响。

1.2.5.3 体系pH对双水相体系的影响 在15% TritonX-100-15%（NH4）2SO4组成的双水相体系中，粗提液的质量分数为12%，NaCl质量分数为0.5%，在室温（25℃）条件下，HCl和NaOH调节双水相体系pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，对上下相溶液进行分析。

1.2.6 Box-Behnken实验设计 根据单因素实验结果，设计黄酮粗提液质量分数、NaCl质量分数、pH 3因素3水平的17组实验，确定双水相体系萃取地榆根总黄酮的最佳萃取条件，见表1。

表1 Box-Behnken设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken Design

1.2.7 反萃取实验

1.2.7.1 上相溶液体积对地榆根总黄酮反萃取效果的影响 取3m L乙酸丁酯加入10m L的刻度试管中，分别加入1、1.5、2、2.5、3m L前萃取上相溶液，在室温（25℃）条件下，对上下相溶液进行分析。

1.2.7.2 乙酸丁酯对地榆根总黄酮反萃取效果的影响 取1.5m L的上相溶液加入10m L的刻度试管中，分别加入1、1.5、2、2.5、3m L乙酸丁酯，在室温（25℃）条件下，对上下相溶液进行分析。

1.2.8 数据整理和分析 所有实验均重复3次，采用Excel 2003和Design-Expert 7.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1（NH4）2SO4质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响 由图1可知，当（NH4）2SO4质量分数达到15%时，总黄酮萃取率和分配系数都达到最大，此后，随着（NH4）2SO4质量分数的不断增加，总黄酮萃取率和分配系数都显著下降。这是因为（NH4）2SO4用量不同，上下相电位差不同，影响分配系数和萃取率。另外，（NH4）2SO4质量分数过大影响黄酮表面疏水性，且扰乱双水相体系，改变各项中成相物质的组成。因此，（NH4）2SO4质量分数最佳选择15%。

图1 硫酸铵质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.2 TritonX-100质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响 由图2可知，随着TritonX-100质量分数的不断增加，萃取率和分配系数先是不断上升，当TritonX-100质量分数达到15%时，总黄酮萃取率和分配系数都达到最大，此后，随着TritonX-100质量分数的不断增加，总黄酮萃取率和分配系数都显著下降，萃取率和分配系数的变化基本是同步的。其原因可能是由于表面活性剂具有两亲基团，其胶束具有自组装的特性，胶束的形状和大小可通过改变双水相体系组成条件进行调节［10］，表面活性剂能起增溶作用，增加地榆根黄酮在上相中溶解性。但是，当TritonX-100质量分数过大时，地榆中其他成分溶出量也会增加，影响黄酮萃取效果。因此，选择TritonX-100的最佳质量分数为15%。

图2 TritonX-100质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.2 Effect of TritonX-100mass concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.3 粗提液质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响 由图3可知，当粗提液质量分数在12%时，地榆根总黄酮的萃取率和分配系数达到最大。主要原因是随着粗提液质量分数逐渐增加，粗提液中鞣质和蛋白质也被萃取到双水相体系上相，阻碍了粗提液中黄酮的萃取。可见，粗提液的质量分数影响上下相的分配，当粗提液的质量分数为12%时，地榆根总黄酮的萃取率和分配系数达到最大。因此，确定粗提液的最佳质量分数为12%。

图3 粗提液质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.3 Effect of crude extracts concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.4 pH对地榆根总黄酮分配行为的影响 如图4所示，当pH＜6时，随着pH增大分配系数和萃取率逐渐增大；pH为6时分配系数和萃取率达最大；当pH＞6时，分配系数和萃取率随pH的增大而减小。这是因为黄酮的酚羟基在水溶液中能电离出氢离子，在不同pH的水溶液中，以分子形式存在的黄酮和以离子形式存在的黄酮比例不同。当体系pH为6时，萃取过程中黄酮以分子形式被萃入双水相体系上相，因此，当pH为6时，地榆根总黄酮的萃取率和分配行为最佳。

图4 pH对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.4 Effect of pH on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.5 NaCl质量分数对地榆根总黄酮分配行为的影响 由图5可知，随着NaCl质量分数的增加，地榆根总黄酮的萃取率和分配系数也随着增大，当NaCl质量分数为0.5%左右时，地榆根总黄酮的萃取率达到最大值，再继续增加NaCl的量，地榆根总黄酮的萃取率和分配系数开始下降。其原因是无机盐的加入可以改变两相间的电位差和相比，缩短了分相时间，提高了相分离速度，从而增加了总黄酮在上相的分配，但盐质量分数增加到一定程度后，萃取相的极性增强，使总黄酮的溶解度下降导致出现盐析现象，使分配系数降低。因此，确定NaCl的最佳质量分数为0.5%。

2.2 响应面结果分析

通过以上单因素实验结果分析，在确定双水相体系组成的基础上，采用响应面方法进一步优化实验条件。根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以萃取率为响应值，在TritonX-100-（NH4）2SO4双水相体系中，对粗提液质量分数（A）、NaCl质量分数（B）、pH（C）设计了3因素3水平的17组实验，其中有5组中心点重复实验，实验方案和结果见表2。

图5 NaCl对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on Sanguisorba officinalis L. root total flavonoids distribution behavior

表2 Box-Behnken设计方案与结果Table 2 Arrangementand results of Box-Behnken Design

2.2.1 Box-Benhnken Design实验数据分析 以地榆根总黄酮萃取率Y为响应值，根据表2的实验结果，用Design-Expert 7.0软件进行多元回归分析，具体结果见表3。经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可用以下回归方程表示：

由表3可以看出，本模型拟合程度明显，其F= 146.5681，p＜0.0001，说明该模型极显著；失拟项不显著，其失拟检验的F值为6.513554，存在5.1%的概率失拟，失拟项在α=0.05水平上不显著（p=0.0510＞0.05），模型的R2为0.994721，说明该模型的可信度很高，表中p＜0.01，对应项为模型影响极显著项，因此该模型中A、AB、AC、BC、A2、B2、C2极显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：粗提液质量分数（A）＞pH（C）＞NaCl质量分数（B）。

表3 Box-Behnken实验结果的回归分析Table 3 The regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.2.2 响应面优化及模型验证实验 响应面图形是本实验中的响应值对各个实验因子：粗提液质量分数、NaCl质量分数、pH构成的响应面图，结果如图6所示，AB、AC、BC对地榆根总黄酮萃取率极显著。当pH固定不变，一定范围内，总黄酮萃取率随着粗提液质量分数和NaCl质量分数增加而增大，两者交互作用极显著。当NaCl质量分数固定不变，一定范围内，随着粗提液质量分数和pH增加，地榆根总黄酮萃取率逐渐增大到最大值然后下降。当粗提液质量分数固定不变，一定范围内，随着NaCl质量分数和pH增加，地榆根总黄酮萃取率逐渐增大到最大值然后下降。

根据Box-Behnken实验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design-Expert 7.0软件获得了各个因素的最佳条件组合：粗提液质量分数12.18%、NaCl质量分数0.495%、pH6.05，萃取率为80.8008%。根据实验操作实际条件，对最佳条件修正为：粗提液质量分数12%、NaCl质量分数0.5%、pH 6，在此萃取条件下，进行3次重复实验，地榆根总黄酮的平均萃取率可达80.02%。可见，采用响应面分析法对地榆根总黄酮最佳萃取条件的优化是行之有效的。

2.3 反萃取实验

在前萃取基础上，对地榆根总黄酮进行反萃取。探讨上相溶液、乙酸丁酯加入体积对地榆根总黄酮反萃取效果的影响。

2.3.1 上相溶液体积对地榆根总黄酮反萃取效果的影响 由图7可知，随着上相溶液体积的增加，反萃取率和分配系数先上升，当上相溶液体积达到1.5m L时，总黄酮反萃取率和分配系数都达到最大，此后，随着上相溶液体积的不断增加，总黄酮分配系数和反萃取率趋于稳定。因此，选择上相溶液体积1.5m L时为最佳。

图6 各因素交互作用的响应面图Fig.6 Response surface plots for the pairwise interactive effects

图7 上相加入量对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.7 Effect of upper phase addition amounton Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution

2.3.2 乙酸丁酯对地榆根总黄酮分配行为的影响 由图8可知，随着乙酸丁酯量的不断增加，反萃取率和分配系数先是不断上升，当乙酸丁酯达到2m L时，总黄酮反萃取率和分配系数都达到最大，此后，随着乙酸丁酯量的不断增加，总黄酮反萃取率和分配系数都显著下降。因此，选择乙酸丁酯2m L时为最佳。

图8 乙酸丁酯对地榆根总黄酮分配行为的影响Fig.8 Effect of butyl acetate on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution

2.3.3 最佳反萃取验证实验 依次加取1.5m L上相溶液，2m L乙酸丁酯入10m L的刻度试管中，在室温（25℃）条件下，对上下相溶液进行分析，得到地榆根总黄酮反萃取率为80.03%。

3 结论

TritonX-100-（NH4）2SO4双水相中TritonX-100质量分数、（NH4）2SO4质量分数、粗提液质量分数、pH、NaCl质量分数等因素都对双水相体系的萃取率和分配系数有一定的影响，并且确定了双水相体系组成为15%TritonX-100和15%（NH4）2SO4；得到了地榆根总黄酮的最佳萃取条件：粗提液质量分数12%、NaCl质量分数0.5%、pH 6，萃取率达到80.02%；反萃取的最佳条件：将1.5m L黄酮上相和2m L乙酸丁酯进行反萃取，反萃取率为80.03%。因此，本实验说明采用TritonX-100-（NH4）2SO4双水相体系分离纯化地榆根总黄酮是可行的。

［1］满茹.识别真假地榆［J］.开卷有益（求医问药），2013（10）：52.

［2］刘欣.地榆中酚类成分的研究［D］.长春：吉林大学，2013.

［3］彭诚.地榆总鞣质提取、纯化及活性研究［D］.长春：吉林大学，2012.

［4］周国忠，朱磊，刘婉莹.地榆药材的研究与探讨［J］.北方药学，2012，9（4）：30-31.

［5］姜贵全，方贵珍.地榆根中总黄酮的提取工艺［J］.东北林业大学学报，2007，35（1）：63-67.

［6］姜贵全.地榆中药用活性成分提取工艺及稳定性研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2005.

［7］于慧荣，赵文英，朱兆友.加压提取地榆根中黄酮成分的研究［J］.天然产物研究与开发，2011，23（3）：449-452.

［8］谢红国，王跃军，孙谧.TritonX-100-无机盐双水相体系的相平衡模型及碱性蛋白酶在该体系中的分配系数模型［J］.化工学报，2006，57（9）：2027-2031.

［9］张斌，兰萍，马龙，等.大孔树脂分离纯化花生壳总黄酮的研究［J］.中国粮油学报，2010，5（2）：126-129.

［10］朱慎林，朴香兰，沈刚.表面活性剂双水相萃取分离氨基酸研究［J］.2006，34（3）：4-6.

Optimization of TritonX-100-（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction of total flavonoids from Sanguisorba officinalis L.root

LIXue-juan1，ZHANG Ting-feng2，*
（1.Gansu Provincial Hospital of TCM，Lanzhou 730050，China；2.The College of Agriculture and Biotechnology（CAB），Hexi University，Zhangye 734000，China）

Objective:To study the extracting process of total flavonoids in the roots of Sanguisorba officinalis L.by using aqueous two-phase system. Methods:The effects of TritonX-100 concentration，ammonium sulfateconcentration，crude extract concentration，NaCl concentration and pH value on the extraction efficiency of totalflavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods. Results:The optimalaqueous two-phase extraction conditions were 15％ TritonX-100，15％ ammonium sulfate，crude extract massconcentration 12％，NaCl concentration 0.5％ and pH6. The forward extraction yields of total flavonoids reached80.02％. The optimal condition of backward extraction were as follows:butyl acetate 2mL，the upper phase1.5mL. The efficiency of backward extraction was 80.03％. Conclusion:This method was not only simple but alsolow-cost. Therefore it would have a well application perspective.

Sanguisorba officinalis root；total flavonoids；aqueous two-phase；back extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.047

2014－04－10

李学娟（1979-），女，本科，药师，主要从事药物化学成分方面的研究。

*通讯作者：张挺峰（1979-），男，硕士，讲师，主要从事高山植物生物学方面的研究。