直投式复合菌剂泡菜循环发酵中辅料配方的优化及品质分析

黄道梅，孙 娟，刘书亮，2，*，胡欣洁，2，韩新锋，2，何 利，2，周 康，2，颜正财

（1.四川农业大学食品学院，四川雅安625014；2.四川省农产品加工及贮藏工程重点实验室，四川雅安625014；3.四川吉香居食品有限公司，四川眉山620039）

直投式复合菌剂泡菜循环发酵中辅料配方的优化及品质分析

黄道梅1，孙 娟1，刘书亮1，2，*，胡欣洁1，2，韩新锋1，2，何 利1，2，周 康1，2，颜正财3

（1.四川农业大学食品学院，四川雅安625014；2.四川省农产品加工及贮藏工程重点实验室，四川雅安625014；3.四川吉香居食品有限公司，四川眉山620039）

以戊糖片球菌、植物乳杆菌为直投式复合菌剂，以萝卜、莴笋等为原料。研究复合菌剂发酵泡菜、老盐水发酵泡菜和自然发酵泡菜三种不同工艺发酵过程中感官、理化及微生物指标的变化规律，并对泡菜成熟时达到的平衡体系进行研究，通过取出成熟泡菜、再添加原、辅料来实现泡菜循环发酵。结果表明，复合菌剂发酵泡菜与其他两种发酵方式泡菜相比，感官品质较优、亚硝酸盐含量更低（最高仅为1.51mg/kg）、乳酸菌数更高（约108CFU/g）。通过控制菜水比为1∶1，以及发酵过程中辅料（食盐、冰糖、香料汁）的补加量实现泡菜的循环发酵，单因素和正交实验确定了泡菜循环发酵过程中食盐、冰糖、香料汁的补加量分别为3.50%、3.75%和3.75%，且每批次泡菜品质均无显著差异。

直投式复合菌剂，循环发酵，泡菜，辅料配方，品质

泡菜富含以乳酸菌为主的益生菌群，风味独特、营养丰富，具有助消化、抗氧化、预防肿瘤、降低胆固醇等特点，乃生津开胃之首选，享誉国内外［1-3］。以四川泡菜为代表的中国泡菜，已与韩国泡菜、日本泡菜齐名。四川泡菜在国内市场的占有率达50%以上，产品远销国外。然而，富含活性乳酸菌的传统四川泡菜产量却很小。同时日、韩两国均在不断扩大其泡菜市场，这对我国的泡菜产业产生了巨大的冲击，中国传统泡菜产业亟待现代化［4］。

近年来，研究者对发酵泡菜专用的直投式菌剂制备的研究较多［5-6］，并在直投式乳酸菌菌剂发酵泡菜的工艺、特性方面的研究也有一定进展［7-8］。相比于传统发酵方式，直投式菌剂发酵泡菜可明显缩短发酵周期，提高泡菜中各种有机酸、氨基酸和有机醇的总量，还能大幅度降低亚硝酸盐含量［9-10］。而泡菜循环发酵是指按照泡菜的工艺发酵蔬菜，待其成熟后，将泡菜捞出，再添加一定量的蔬菜和相应的辅料，继续发酵至成熟，然后再捞出、再补加原辅料，如此循环进行的一个发酵过程。实现泡菜的循环发酵可以最大限度地保持泡菜品质的稳定性，缩短生产周期，减少盐水排放，节约生产成本，推进泡菜产业发展。目前，对于泡菜循环发酵的研究少见报道，仅有颜正财等［11］进行有关连续式泡菜发酵装置的研究，于培星等［12］研究了乳酸菌循环发酵的动力学过程，叶仁礼等［13］关于速成泡菜及其循环工艺进行了探讨，然而对于泡菜循环发酵过程中原辅料的变化鲜有报道。因此，本实验选用具有优良发酵性能的植物乳杆菌和戊糖片球菌作为复合菌剂，萝卜、莴笋等为原料，对比三种泡菜（复合菌剂发酵泡菜、老盐水发酵泡菜、自然发酵泡菜）品质变化，探讨实现泡菜循环发酵的原辅料变化参数，为传统四川泡菜的规模化生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌P158（以下简称P158）冻干菌剂（7.32× 1011CFU/g）、戊糖片球菌PP（以下简称PP）冻干菌剂（6.43×1010CFU/g） 使用时制成菌剂质量比（P158∶PP）为1∶11.4（菌含量约为1∶1）的复合菌剂（1.18×1011CFU/g），由四川农业大学食品学院食品微生物实验室提供；改良MRS液体培养基［14］；泡菜原料（胡萝卜、白萝卜、莴笋、芹菜、辣椒、白酒、含碘食盐等） 均为市售；泡菜老盐水 取自四川农业大学老区食堂，置于4℃冰箱，备用；铬酸钾、亚铁氰化钾、乙酸锌、四硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠等 均为分析纯；邻苯二甲酸氢钾、氯化钠 均为基准试剂。

UV-3200（PC）紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PB-2B pH计 SARTORIUS；CJBQ磁力搅拌器 山西太华磁有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜的制作工艺 按复合菌剂接种发酵（以蔬菜质量的0.05%菌粉计）、老盐水发酵（不接菌粉，老盐水为蔬菜质量的25%）和自然发酵（不接菌粉和不使用老盐水）3种方式制作泡菜，分析发酵过程中的品质变化，操作要点如下。

1.2.1.1 原料准备 挑选新鲜脆嫩、成熟适度，组织致密，无病虫害及霉变的胡萝卜、白萝卜、莴笋、小红椒、芹菜，去除衰老、坏死部分。用0.008g/kg次氯酸钙溶液浸泡5min进行消毒，用无菌水冲洗至无氯味后沥干。胡萝卜、白萝卜、莴笋切分为4cm长×1cm宽× 1cm厚的长条，小红椒、芹菜切成2cm小段，其配比为16∶16∶16∶1∶1。

香料汁：称取适量八角、香叶、桂皮、青花椒、冰糖、小红椒、生姜、大蒜、芹菜于3000m L饮用水中，小火微沸熬制3h。用纱布过滤得1000m L香料汁。

补加用水：量取4000m L饮用水，煮沸并冷却至室温，备用。

1.2.1.2 装坛发酵 将处理好的蔬菜条按1500g/坛分装于3L泡菜坛（75%酒精消毒后）中，采用复合菌剂、老盐水、自然方式发酵，并按1.2.3中实验设计添加食盐、冰糖、香料汁，按蔬菜与水质量比为1∶1补加凉开水，室温（日均最高、低气温为25、14℃）密封发酵。每隔12h取泡菜样品研磨，按1∶1加入蒸馏水，测定pH。当pH下降至3.6时，结合泡菜色泽、口感等确定发酵终点。

1.2.2 泡菜品质分析

1.2.2.1 感官评价 参照文献［15］中泡菜感官评定评分标准略改动，10人评价小组对产品的形态、色泽、气味、口感和脆度进行感官评价，对应的评价得分集=［很差（2），较差（4），一般（6），较好（8），很好（10）］，评价结果用SPSS软件进行分析。

1.2.2.2 部分理化指标测定 pH：精密pH计测定，参照GB/T 10468-1989。总酸：酸碱中和法测定，参照GB/T 5009.51-2003。盐度：AgNO3标准溶液滴定法测定，参照GB/T 5009.51-2003。亚硝酸盐：盐酸萘乙二胺法测定，参照GB 5009.33－2010。

1.2.2.3 乳酸菌数测定 采用平板菌落计数法，参照GB 4789.36-2010。

1.2.3 泡菜循环发酵工艺中辅料配方的优化

1.2.3.1 单因素实验 复合菌剂发酵泡菜成熟后，将泡菜全部捞出并舀出少量发酵液，使捞出菜和水与装坛时添加的蔬菜等重。参考文献［16］并根据预实验情况，按菜与液体的比为1∶1补加蔬菜，设计以下单因素实验确定食盐、冰糖、香料汁适宜添加量。

a.补加食盐用量的确定 在菌剂发酵泡菜成熟后的泡菜水中补加冰糖3%、香料汁4%，再分别补加食盐2%、2.5%、3%、3.5%、4%，搅拌溶解后，加入蔬菜，密封发酵至成熟，通过测定pH、总酸、盐度比较泡菜成品品质，确定食盐的适宜用量X。

b.补加冰糖用量的确定 在菌剂发酵泡菜成熟后的泡菜水中补加香料汁4%、食盐3%，再分别补加冰糖2%、2.5%、3%、3.5%、4%，搅拌溶解后，加入蔬菜，密封发酵至成熟，通过测定pH、总酸、盐度比较泡菜成品品质，确定冰糖的适宜用量Y。

c.补加香料汁用量的确定 在菌剂发酵泡菜成熟后的泡菜水中补加冰糖3%、食盐3%，再分别补加香料汁3%、3.5%、4%、4.5%、5%，密封发酵至成熟，通过测定pH、总酸、盐度比较泡菜成品品质，确定香料汁的适宜用量Z。

1.2.3.2 正交实验 根据a～c各补加原料的最佳水平设计正交实验，正交因素水平表见表1，以总酸、盐度与第1次发酵成品的偏差最小来确定各辅料的适宜补加量。偏差是指各实验组与第1次复合菌剂发酵泡菜总酸、盐度的差值，其中总酸、盐度各占50%的权重，其表达式为：偏差=｜总酸实验组－总酸第一次发酵｜×50% +｜盐度实验组－盐度第一次发酵｜×50%。

按正交实验优化所得的适宜用量，进行第2～5次循环发酵，并考察泡菜成品的品质，分析同1.2.2。

表1 补加辅料正交实验因素水平表Table 1 Orthogonal test factors level table of adding auxiliarymaterials

1.2.4 数据处理 实验数据及其图表绘制采用EXCEL、Origin 7.5、SPSS 19.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 三种方式发酵泡菜感官评价结果

对三种方式发酵泡菜到达各自发酵终点时分别进行了感官评价，并对不同发酵方式之间采用SPSS 19.0软件进行了显著性分析。从评价结果（表2）看，复合菌剂发酵的泡菜得分最高，老盐水发酵泡菜居中，自然发酵泡菜最低。复合菌剂发酵泡菜在色泽方面与老盐水发酵泡菜差异不显著（p＞0.05），但在形态、气味、口感、脆度方面均优于老盐水发酵泡菜（p＜0.05）。

2.2 三种方式发酵泡菜pH及总酸含量的变化

三种方式发酵泡菜发酵过程中pH及总酸含量的变化如图1所示。由图1可知，复合菌剂发酵泡菜约48h后，泡菜pH降至3.51＜3.6，总酸含量为0.33g/100g，泡菜成熟。老盐水发酵泡菜约48h，泡菜pH降至3.54＜ 3.6，总酸含量为0.34g/100g，泡菜成熟。自然发酵泡菜84h后，泡菜pH降至3.59＜3.6，总酸含量为0.32g/100g，泡菜成熟。泡菜发酵过程中，三种发酵泡菜汁液的pH均不断降低、总酸含量不断增加。然而，相比于复合菌剂发酵而言，自然发酵的酸度增加速度相对缓慢，增长幅度较小，两者之间的差异明显，这与熊涛［17］、寿禹亮等［18］的研究报道一致，其原因可能是发酵体系中含有许多杂菌如霉菌、酵母菌、细菌等，在发酵初期它们均能生长，与乳酸菌竞争营养，一定程度上抑制了乳酸菌的生长繁殖和产酸。由此分析可知，复合菌剂和老盐水发酵泡菜可明显缩短发酵周期，可提高生产效率。

图1 三种方式泡菜发酵过程中pH和总酸的变化Fig.1 Changes of pH and acid concentration during fermenting process of 3 kinds pickles

2.3 三种方式发酵泡菜盐度及亚硝酸盐含量的变化

由图2可知，三种发酵方式制成的泡菜在整个发酵过程中的盐度总体呈上升趋势。老盐水发酵盐度高于复合菌剂和自然发酵；复合菌剂发酵泡菜最终盐度为2.9%左右，与自然发酵泡菜的盐度相当。三种方式发酵的盐度均低于四川低盐泡菜的标准（食盐含量≤6%）［19］，老盐水发酵的盐度明显高于复合菌剂发酵和自然发酵，而复合菌剂和自然发酵两者盐度相当，盐度均低于超低盐泡菜的标准（食盐含量≤3%）［19］。腌、泡菜的低盐化，是当今食品发展的总趋势［20-21］。基于安全、营养方面，复合菌剂发酵明显优于老盐水发酵。

图2 三种方式泡菜发酵过程中盐度和亚硝酸盐含量的变化Fig.2 Changes of saltand nitrite concentration during fermenting process of 3 kinds pickles

表2 三种方式发酵泡菜感官评价结果Table 2 Results of sensory evaluation for 3 kinds of pickles

三种泡菜发酵过程中，复合菌剂发酵与老盐水发酵制得的泡菜亚硝酸盐含量很低，复合菌剂发酵泡菜略低于老盐水发酵泡菜；自然发酵泡菜在发酵24h后，亚硝酸盐含量迅速升高，发酵60h，其含量为12.11mg/kg，是复合菌剂发酵泡菜亚硝酸盐含量的8倍；复合菌剂发酵泡菜在发酵过程中亚硝酸盐含量最高为1.51mg/kg，老盐水发酵泡菜最高为2.80mg/kg，说明复合菌剂发酵泡菜能降低产品亚硝酸盐含量。很多实验表明，直投式菌剂或乳酸菌发酵泡菜可以降低泡菜中亚硝酸盐的残留量［22-23］。由于复合菌剂和老盐水发酵液中的乳酸菌含量远高于自然发酵中的乳酸菌含量，因此，前两者发酵过程中能快速生成大量有机酸或降解酶，加快了亚硝酸盐的降解［24］。亚硝酸盐含量高低直接影响泡菜品质及食用安全性。从亚硝酸盐的变化来看，相对于自然发酵泡菜来讲，复合菌剂发酵泡菜食用更为安全。

2.4 三种方式发酵泡菜中乳酸菌数量的变化

如图3所示，三种方式泡菜发酵过程中的乳酸菌数总体趋势为上升后趋于稳定。复合菌剂与老盐水发酵泡菜中的乳酸菌活菌数初始值为106.5CFU/g左右，且明显高于自然发酵泡菜。三种发酵方式发酵的泡菜中的乳酸菌数量在24h达到一定量，并趋于平衡。复合菌剂发酵泡菜中乳酸菌活菌数（108CFU/g）与老盐水发酵相当，自然发酵的乳酸菌活菌数（107.5CFU/g）低于另外两种发酵方式。在整个发酵过程中，复合菌剂和老盐水发酵液中乳酸菌的数量一直高于自然发酵，也体现了其缩短泡菜发酵周期的作用。

图3 三种方式泡菜发酵过程中乳酸菌数量变化Fig.3 Variation of LAB counts during fermenting process of 3 kinds pickles

2.5 泡菜循环发酵工艺中辅料配方的优化结果

2.5.1 单因素实验确定辅料的补加量 补加不同用量的食盐、冰糖、香料汁制作的成熟泡菜的总酸、盐度与第一次复合菌剂发酵泡菜的偏差结果见表3，并对不同因素各水平之间采用SPSS 19.0软件进行了显著性分析。由表3可知，食盐、冰糖、香料汁的适宜补加量分别为3.5%、3.5%、3.5%。

表3 泡菜循环发酵中辅料补加量的单因素实验结果Table 3 Single factor experiment result of adding auxiliarymaterials during cycle fermentation

2.5.2 泡菜循环发酵中辅料补加量的正交实验结果

对泡菜循环发酵中辅料（食盐、冰糖、香料汁）补加量的正交实验及方差分析结果见表4、表5。由表5可知，原料补加量对泡菜总酸、盐度影响的主次顺序依次为香料汁、冰糖、食盐，且影响为极显著（p＜0.01），其最佳配方为食盐3.5%，冰糖3.75%，香料汁3.75%。

表4 补加辅料用量正交优化结果Table 4 Results of orthogonal optimization adding auxiliarymaterials

表5 方差分析结果Table 5 Results of variance analysis

2.5.3 循环发酵泡菜品质的比较

a.感官评价 第2～5次发酵的泡菜，在感官上均优于第1次复合菌剂发酵的泡菜，其得分均在8.9以上（p＞0.05）。泡菜色泽好、清香扑鼻、咸淡适中、咀嚼有脆性、口感好。

b.理化指标 第1～5次发酵泡菜在发酵过程中总酸、盐度和亚硝酸盐的变化如图4所示。循环发酵过程中，总酸基本维持在0.30g/100g左右（p＞0.05），盐度略有上升趋势，介于2.8g/100g到3.0g/100g之间。在第2次发酵时，亚硝酸盐有明显下降，2～5次发酵过程中一直维持一个低水平，小于0.37mg/kg，远小于NY/T 437-2012绿色食品酱腌菜（≤4mg/kg）标准。

图4 泡菜循环发酵中总酸、盐度和亚硝酸盐的变化Fig.4 Changes of acid concentration，salinity and nitrite during cycle fermentation

c.乳酸菌数 5次循环发酵过程中，乳酸菌活菌数大体维持稳定，略有下降，基本维持在108CFU/g左右（p＞0.05）。

3 结论

通过比较复合菌剂发酵、老盐水发酵、自然发酵三种泡菜在感官及理化指标、乳酸菌数的差异，表明复合菌剂发酵泡菜工艺可快速提高产酸速度，明显缩短发酵时间，在泡菜品质以及食用安全性方面均优于其他两种发酵方式。通过控制发酵过程中辅料（食盐、冰糖、香料汁）的补加量可实现泡菜的循环发酵，单因素实验和正交优化实验确定了泡菜循环发酵过程中，菜水比1∶1，食盐、冰糖、香料汁的补加量分别为3.50%、3.75%和3.75%，按此循环工艺生产的泡菜质量稳定，可缩短泡菜生产周期，减少盐水排放，为推进泡菜的产业化发展提供了参考。

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Optimization of auxiliary recipe and quality analysis of
pickles cycle fermentation by direct vat set com pound starters

HUANG Dao-mei1，SUN Juan1，LIU Shu-liang1，2，*，HU Xin-jie1，2，HAN Xin-feng1，2，HE Li1，2，ZHOU Kang1，2，YAN Zheng-cai3
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China；2.Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province，Ya'an 625014，China；3.Sichuan Jixiangju Food Co.，Ltd.，Meishan 620039，China）

Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum were direct vat set（DVS）compound starters and the materials were radish，lettuce and so on.Studying dynamic changes fermenting process of 3 kinds pickles by DVS compound starters，bisk fermentation and natural fermentation in sensory indexes，physical and chemical indexes，microbiology indicators.And studying balance system with matured pickles，taking out matured pickles and adding material to realize the cycle of pickle fermentation.Results showed that pickles with compound starters had better sensory evaluation，lower concentration nitrite（the highestwas 1.51mg/kg），more lactic acid bacteria（about 108CFU/g）than other two fermentation manners.Control vegetable and water was 1∶1 and the adding quantity of sugar，salt and the juice of sp ices in the fermentation process could realized the cycle of pickles fermentation，single factor experiment and orthogonal experiment determined the adding quantity of salt，sugar and juice of sp ices were 3.50%，3.75%and 3.75%，respectively，and quality of each batch pickles was no obvious difference.

direct vat set com pound starters；cycle fermentation；pickles；auxiliary recipe；quality

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.031

2014－06－05

黄道梅（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物。

*通讯作者：刘书亮（1968-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物。

四川省科技厅科技支撑计划（2013NZ0055）。