基于ITS和IGS1序列分析对云南牛肝菌的分类鉴定

岳万松，熊 勇，王燕彩，陈毅坚，2，*

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650500；2.国家民委-教育部共建民族药资源化学重点实验室，云南昆明650500；3.昆明理工大学环境科学与工程学院，云南昆明650500）

基于ITS和IGS1序列分析对云南牛肝菌的分类鉴定

岳万松1，熊 勇1，王燕彩3，陈毅坚1，2，*

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650500；2.国家民委-教育部共建民族药资源化学重点实验室，云南昆明650500；3.昆明理工大学环境科学与工程学院，云南昆明650500）

以采自云南地区的5个牛肝菌（Boletus sp.）样品为材料，根据样品的形态特征，并结合rDNA ITS和IGS1序列分析对5个样品进行分类鉴定，通过与GenBank上已登录的牛肝菌序列比对，采用邻接法（neighbor-joining，N-J）构建系统发育树。结果表明，所有供试材料的ITS和IGS1全长分别在739～787bp和537～583bp范围内，GC含量分别在48.31%～51.01%和48.42%～52.89%之间，遗传距离在0.017～0.248和0.002～0.225之间，上述数据表明云南5个牛肝菌样品之间存在一定的遗传差异。5个牛肝菌样品的ITS和IGS1序列聚类分析均表明，供试样品被分为两大类，其中样品YX1-2和QJ3-4聚为一个类群，样品CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚为另一个大的类群，两种分析手段相互印证，且ITS序列聚类分析能将云南不同地点的牛肝菌鉴定到属甚至种的水平，上述分析结果表明ITS和IGS1序列分析相结合可作为牛肝菌亲缘关系鉴定的有效分子标记方法。

牛肝菌，ITS序列，IGS1序列，分子鉴定

野生牛肝菌（Natural Boletus sp.），又名大脚菇，隶属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，牛肝菌科，牛肝菌属［1］，是世界珍贵的一类食药兼用的食用菌。主要分布在我国西南和华南地区及东北和华东沿海各省，云南是全球野生食用菌最为丰富的地区之一，尤其是牛肝菌资源［2］。野生牛肝菌富含多种氨基酸、活性多糖、蛋白质和维生素等多种营养成分［3］，其子实体具有提高人体免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤及抗氧化等药理作用［4-8］。

由于牛肝菌物种多样性丰富，种间形态相似性高，形态学鉴定相对较困难，各种牛肝菌所含成分有差异，有的甚至含有毒素，但普通民众一般是“以貌择食”的方式来选择食用牛肝菌，因此常有食用牛肝菌中毒的事件发生。因此，探索新的方法来鉴定商品牛肝菌中的混淆毒菌很有必要。

随着分子生物学的快速发展，基因序列分析对比成为了现实，对真核生物rDNA的研究中，基于ITS序列分析鉴定食用菌的技术已被广泛应用［9-11］，此外，由于IGS区变异相对较快，且各重复单位间具有同步进化的特点，因此也常用于种间、种内、近缘类群、杂交类群等关系的研究［12］。在食用菌的研究中，已有研究者对香菇（Lentinus edodes）和白灵侧耳（Pleurotus nebrodensis）商业栽培菌株的IGS1和IGS2区域进行研究，表明这些食用菌种内菌株间IGS序列存在显著的差异［13-14］。但是以IGS序列碱基差异分析牛肝菌种内的遗传多样性及系统演化关系的报道较少见。

本研究用PCR方法扩增云南5个牛肝菌样品的rDNA ITS和IGS1序列分析序列并测序，利用生物信息技术对测序结果分析比较，揭示牛肝菌系统发育关系，旨在为研究牛肝菌的系统演化规律以及品种间亲缘关系提供一些新的分子生物学资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肝菌 实验用5个新鲜牛肝菌子实体样品，均于2013年8～9月分别购自云南省玉溪市、曲靖市和楚雄市集贸市场，新鲜子实体用保鲜袋包装带回实验室，根据形态特征进行初步分类（表1），表1中5个样品形态特征的初步分离鉴定参考《中国大型真菌》［15］和《云南牛肝菌图志》［16］；引物LR12R、M-1和DNA MarKer北京博迈德生物；2×Power Taq PCR Master Mix

表1 供试牛肝菌样品及来源Table 1 Tested strains of Boletus and origins

北京百泰克；

Eppedorf 5331 PCR仪 德国；GENE GENIUS凝胶成像系统 美国；DYY-GB电泳仪、DYCP-31DN电泳槽 北京六一。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 牛肝菌总DNA提取方法参照CTAB-SDS法［17-18］并加以改良，即醇析DNA时，使用2倍上清液体积的异丙醇要先在-20℃预冷，并同时加入1/10倍上清液体积的3mol/L KAc（pH 8.0），然后在4℃冰箱放置15m in来加速絮状DNA的沉淀。用琼脂糖凝胶电泳检测样品DNA质量。

1.2.2 PCR扩增、测序 IGS1通用引物（LR12R：5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3'；M-1：5'-AACC ACAGCACCCAGGATTCCC-3'）［19］，ITS通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）［20］，2个序列PCR扩增共用同一个50μL反应体系，体系包括：25μL 2×Power Taq PCR M ixture，引物各2μL，5μL DNA模板，16μL ddH2O；ITS反应条件：预变性94℃ 5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，35次循环，72℃10m in，4℃保存；IGS1反应条件：预变性94℃5m in，94℃30s，56℃30s，72℃30s，35次循环，72℃10m in，4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，采用Bio-Rad凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 PCR产物的纯化、测序及系统发育树的构建PCR产物用多功能DNA纯化回收试剂盒回收，送昆明硕阳科技有限公司测序，测序结果DNAMAN进行拼接，将得到的序列提交GenBank数据库，并通过在线Blast工具从NCBI下载GenBank等数据库内已知同源序列多条作为参考序列。用MEGA 5.1软件包进行系统发育分析和系统发育树的构建。用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter模式计算遗传距离，所有对位排列结果中的空位或缺失数据作完全删除处理，采用邻接法（neighbor-joining，N-J）构建聚类图，系统树的每个分支的统计学显著性分析以Bootstrap方法进行检验，重复次数为1000次。

2 结果与分析

2.1 5个牛肝菌样品IGS1和ITS序列PCR扩增结果

从图1和图2可见，5个牛肝菌样品IGS1序列长度约在500～700bp之间，ITS序列长度约在700～900bp之间，PCR产物均出现清晰明显的条带，说明实验所提的DNA质量较好。

2.2 5个牛肝菌样品IGS1和ITS序列的差异性分析

通过DNAMAN和MEGA 5.1对不同牛肝菌样品测序结果分析，5个牛肝菌样品YX1-2（白牛肝，玉溪易门）、YX1-3（红见手青，玉溪易门）、QJ3-4（白牛肝，曲靖潇湘）、QJ3-5（红见手青，曲靖马龙）和CX2-10（风手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列长度为537～583bp，两端切平后长度为537bp，GC含量为48.42%～52.89%，ITS序列长度为739～787bp，两端切平后长度739bp，GC含量为48.31%～51.01%（见表2）。

图1 5个牛肝菌IGS1-PCR扩增电泳图Fig.1 Amplification profile of electrophoretogram IGS1-PCR of 5 boletus

图2 5个牛肝菌ITS-PCR扩增电泳图Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS-PCR of 5 boletus

表2 牛肝菌rDNA IGS1和ITS序列的长度和GC含量Table 2 Length and GC contents of Boletus rDNA IGS1 and ITS sequences

分析5个牛肝菌IGS1序列长度，结果表明，YX1-2和CX2-10的IGS1序列长度差异最大（46bp），YX1-2和CX2-10的GC含量差异也最大（4.47%），表明牛肝菌属不同种的IGS1序列的长度和GC含量存在较大差异，而样品YX1-3和QJ3-5的IGS1序列不仅长度相同（均为541bp），而且GC含量也相同（均为51.21%），说明二者是属内亲缘关系很近的种，YX1-2和QJ3-4的GC含量差异也较小（0.56%），二者亲缘关系也较近。

分析5个牛肝菌ITS序列长度，结果表明，YX1-2和CX2-10序列长度差异最大（48bp）。YX1-2和QJ3-5的GC含量差异最大（2.7%），YX1-3和QJ3-5的GC含量差异最小（0.13%），说明二者是牛肝菌属内亲缘关系较近的种，YX1-2和QJ3-4的GC含量差异也是0.13%，二者同样是亲缘关系较近的种。这样也与牛肝菌不同种IGS1序列的分析结果基本吻合，说明采用IGS1和ITS序列分析相结合的分析手段对食用牛肝菌分类鉴定是可行的，而且可以相互印证，分析结果更加准确有效。

2.3 5个牛肝菌样品的遗传多样性分析

不同牛肝菌样品间rDNA ITS和IGS1序列的遗传距离及序列距离矩阵构建采用MEGA5.1软件中的Kimura-2-parameter模型进行计算（见表3和表4）。

表3 不同牛肝菌IGS1序列的遗传距离Table 3 Genetic distance among different kinds of Boletus IGS1 Sequence

分析表3结果表明，5个牛肝菌样品YX1-2（白牛肝，玉溪易门）、YX1-3（红见手青，玉溪易门）、QJ3-4（白牛肝，曲靖潇湘）、QJ3-5（红见手青，曲靖马龙）和CX2-10（风手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列间的遗传距离为0.002～0.225，平均0.145。其中，CX2-10与QJ3-4遗传距离最大为0.225，二者亲缘关系最远；其次，QJ3-5与QJ3-4，遗传距离为0.212；YX1-3和QJ3-5遗传距离最小为0.002，二者亲缘关系最近；另外，YX1-2与QJ3-4的遗传距离也较小（0.029），说明二者也是牛肝菌属内亲缘关系较近的两个种。

表4 不同牛肝菌ITS序列的遗传距离Table 4 Genetic distance among different strains of Boletus ITSSequence

分析表4结果表明，5个牛肝菌样品YX1-2（白牛肝，玉溪易门）、YX1-3（红见手青，玉溪易门）、QJ3-4（白牛肝，曲靖潇湘）、QJ3-5（红见手青，曲靖马龙）和CX2-10（风手青，楚雄紫溪山）的ITS序列间的遗传距离为0.017～0.248，平均0.180。其中，CX2-10与YX1-2遗传距离最大为0.248，二者亲缘关系最远；其次，CX2-10与QJ3-4的遗传距离为0.236；YX1-3和QJ3-5遗传距离最小为0.017，二者亲缘关系最近；另外，YX1-2与QJ3-4的遗传距离也较小（0.033），说明二者也是牛肝菌属中亲缘关系较近的种。采用ITS标记对云南不同牛肝菌样品遗传距离和亲缘关系的分析结果与IGS1标记的分析结果基本吻合，上述结果表明IGS1和ITS序列分析相结合可以更准确有效的分析牛肝菌属内不同种的亲缘关系。

2.4 5个牛肝菌样品的系统进化树分析

通过在线Blast工具从NCBI数据库内下载已知的多条相似序列作为参考序列，比较它们的相似性，以NCBI中香菇的IGS1序列和ITS序列为聚类外群，用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter（K2P）模型，采用N-J法对不同牛肝菌进行分析并构建遗传关系树，自举检测1000次（见图3和图4）。

图3 基于IGS1序列构建的NJ系统发育树Fig.3 NJPhylogenetic tree based on IGS1 sequences

IGS1序列聚类分析结果表明，云南不同地点的5个牛肝菌样品YX1-2（白牛肝，玉溪易门）、YX1-3（红见手青，玉溪易门）、QJ3-4（白牛肝，曲靖潇湘）、QJ3-5（红见手青，曲靖马龙）和CX2-10（风手青，楚雄紫溪山）分为2个类群。YX1-2和QJ3-4聚为一个类群，自检支持率为100%，虽然两者生长环境不同但亲缘关系很近，Blast比对结果表明，二者与NCBI库里的Boletus edulis、Boletus pinetorum和Boletus pinophlis菌株聚在一个大支上，但是YX1-2和QJ3-4与它们的相似性都低于95%，不能鉴定为属内同一品种。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚为另一个大的类群，自检支持率为99%，且QJ3-5和YX1-3聚在一个小的分支上，两者生长环境的不同但亲缘关系也很近，但是在NCBI库里没有找到与3个云南牛肝菌相似性比较高的菌株，不能确定三个样品的种属归类。

图4 基于ITS序列构建的NJ系统发育树Fig.4 NJPhylogenetic tree based on ITSsequences

ITS序列聚类分析结果表明，云南不同地点的5个牛肝菌样品YX1-2（白牛肝，玉溪易门）、YX1-3（红见手青，玉溪易门）、QJ3-4（白牛肝，曲靖潇湘）、QJ3-5（红见手青，曲靖马龙）和CX2-10（风手青，楚雄紫溪山）分为2个类群。YX1-2和QJ3-4与NCBI库里的Boletus edulis（美味牛肝菌）、Boletus aestivalis（夏牛肝菌）和Boletus reticulatus（网柄牛肝菌）等菌株聚在同一分支，形成自检支持率为100%的广义美味牛肝菌复合群，且Blast比对结果表明，QJ3-4与库里的Boletus edulis GQ984158、Boletus aestivalis DQ131611和Boletus reticulatus AB821462等广义美味牛肝菌的序列相似度都为99%，可以将QJ3-4与上述菌株同归为广义美味牛肝菌，YX1-2与库里相似性最高的菌株是Boletus edulis EF646278，为97%，表明二者是牛肝菌属内亲缘较近的种。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚为另一个大的类群，其中YX1-3和QJ3-5与NCBI库里的Boletus magnificus DQ407260聚在一个小支上，自检支持率为100%，且Blast比对结果表明，YX1-3和Boletus magnificus DQ407260的相似性高达99%，鉴定为Boletus magnificus（华丽牛肝菌），QJ3-5与它的相似性为98%，可以确定QJ3-5菌株是牛肝菌属内与Boletus magnificus亲缘关系很相近的种，CX2-10与NCBI库里的Boletus speciosus JN903703和Boletus speciosus JN903701相似性分别为98%和97%，三者聚在大类群中是一个小分支上，自检支持率为100%，表明CX2-10是牛肝菌属中与Boletus speciosus（小美牛肝菌）亲缘关系很近的种。

3 结论与讨论

通过传统的分类学手段，对云南不同地点的5个牛肝菌样品进行了初步分类鉴定（见表1），并结合ITS和IGS1序列分析对不同菌株进行系统发育分析，结果表明，将QJ3-4鉴定为广义美味牛肝菌，YX1-3鉴定为Boletusmagnificus（华丽牛肝菌）。此外，YX1-2和Boletus edulis EF646278（美味牛肝菌）相似性为97%，QJ3-5和Boletus magnificus DQ407260（华丽牛肝菌）相似性为98%，CX2-10和Boletus speciosus JN903703（小美牛肝菌）的相似性分为98%，虽然不能将它们与NCBI库里的菌种归为同一个种，但是可以确定它们是牛肝菌属内亲缘关系较近的种。

云南特殊的生境资源，孕育了丰富的大型真菌资源，生态复杂使得云南牛肝菌生物多样性丰富，种间形态相似性较高，通过传统的生物学手段难以鉴定大型真菌，因此需要采用形态学并结合分子生物学手段对其进行鉴定，近年来，ITS标记都具有快速、准确、标准化、引物通用性强、扩增成功率高、便于高通量测序与分析等优点，因此被广泛应于真菌系统发育、种间和种内遗传多样性的研究［21-23］，由于IGS区变异相对较快，且各重复单位间具有同步进化的特点，因此也常用于种间、种内、近缘类群、杂交类群等关系的研究，但是相关报道较少，目前，只见IGS标记应用于香菇和白灵侧耳等少数食用真菌的遗传多样性研究中［13-14］。

本文的研究结果表明，ITS序列聚类分析能将云南不同产地的牛肝菌鉴定到属甚至种的水平，表明ITS序列分析是牛肝菌分离鉴定的有效分子手段之一，且本研究采用的IGS1序列聚类分析与ITS序列聚类分析结果基本一致，二个聚类发育树都将云南不同地点的5个牛肝菌样品分为两个类群。两种分析手段相互印证，使分析结果更加准确有效，所以ITS和IGS1序列分析相结合可作为牛肝菌亲缘关系鉴定的有效分子标记方法。

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Molecular identification of different Boletus in Yunnan based on ITS and IGS1 sequence analysis

YUEW an-song1，XIONG Yong1，WANG Yan-cai3，CHEN Yi-jian1，2，*
（1.School of Chemistry and Bio-technology，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Key Lab of National Medicine Supported Jointly by State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Kunming 650500，China；3.School of Environmental Sciences and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The morphyological characters of five kinds of Boletus in Yunnan were observed，and their rDNA ITSand IGS1 sequences of were measured，analysed and contrasted with the sequences of Boletus having beenlogged in GenBank. Phylogenetic tree was constructed by the obtained molecular data. The results showedthat the total length of all the tested material ITS and IGS1 was respectively within the scope of 739～787bp and537～538bp. the content of GC was respectively within the scope of 48.31％～51.01％ and 48.42％～52.89％，therange of genetic distances was respectively between 0.017～0.248 and 0.002～0.225. The datas showed thatthere was certain genetic differences between five kinds of Boletus. The five kinds of Boletus could be dividedinto two groups by their ITS and IGS1 sequence clustering analysis，YX1-2 and QJ3-4 formed in one group，CX2-10，QJ3-5 and YX1-3 formed into another group，two analytical methods confirm each other，and fivesamples from different regions of Yunnan were identified to genus level and even species based on the ITSsequence clustering analysis，it showed that combining the ITS with IGS1 sequences could effectively identifythe genetic relationship of Boletus.

Boletus；Internal transcribed spacer；Intergenic spacer 1；molecular identification

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.030

2014－07－07

岳万松（1990-），男，硕士研究生，研究方向：食用菌资源开发和利用。

*通讯作者：陈毅坚（1966-），女，博士，教授，研究方向：民族药资源开发和利用。

云南民族大学教育部民委共建重点实验室开放基金项目（MZY1104）；云南省生物技术实验示范中心建设项目（0205-2001015209）；云南民族大学生物技术核心教学团队项目（0205-02010008）。