疏花水柏枝内生真菌对三峡地区柑橘致腐菌的拮抗作用研究

孔玉珊，秦田明，薛艳红，刘士平

（三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443002）

疏花水柏枝内生真菌对三峡地区柑橘致腐菌的拮抗作用研究

孔玉珊，秦田明，薛艳红，刘士平*

（三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443002）

从三峡地区自然腐烂的柑橘果实上分离出一株优势致腐菌，经rDNA-ITS序列分析，发现该菌最近源的属系镰刀菌属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibberella）。同时采用了抑菌圈法分析了三峡地区本地物种疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）内生真菌对柑橘致腐菌的拮抗作用，结果表明在12株高抗氧化活性的内生菌中，有6株内生真菌具有较好的拮抗效果，其中QY1显示出较好的抗氧化性和抑菌活性，对三峡地区柑橘的生物保鲜和防腐有着积极的作用。

疏花水柏枝，内生菌，柑橘，抑菌，抗氧化

三峡地区是我国优质柑橘的主产区之一［1］。但是柑橘采后迅速发生后熟，导致大量的柑橘腐烂，造成巨大的经济损失。柑橘腐烂主要是由于表面的青霉、绿霉等病原真菌导致的霉变，其营养物质将会发生氧化而变质［2-3］。因此抑制这些病原微生物的生长，有助于柑橘的抗氧化、防腐及保鲜。传统上使用冷藏、气调、打蜡等工艺进行防腐保鲜，但这些方法因成本高或者效果不太好逐渐遭到淘汰［4］。化学保鲜法可用来控制柑橘的采后病害，但处理后果品容易变味，糖分降低，同时诱发病原菌的抗药性，还面临食品安全问题［4］。

生物保鲜法为解决上述问题提供了新的契机。一些细菌、酵母或丝状真菌配合一些植物次生代谢产物（主要作为抗氧化剂）能有效控制果实的采后病害，能保持原有风味和营养，是果品贮运保鲜的新潮流［5-7］。由于植物的内生菌不会对植物造成不利影响，近年来也成为生物保鲜剂的一大热点。

疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）分布于三峡库区长江两岸消落带中，每年要经受4个月以上的淹水胁迫（氧化胁迫的一种）［8］。在前期研究中本实验室在淹水胁迫前后的疏花水柏枝中分离出26属163株内生真菌，发现其内生菌具有极强的抗氧化能力（另文发表）。本实验在分离鉴定三峡地区柑橘优势致腐菌的基础上，筛选了对其具有拮抗作用的疏花水柏枝高抗氧化内生菌，以期将抗氧化作用和柑橘致腐拮抗菌的筛选结合，为适合三峡地区柑橘生物保鲜剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

疏花水柏枝内生真菌 为本实验室筛选和保藏；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（g/L） 马铃薯200、葡萄糖20、琼脂15～20，自然pH；次氯酸钠溶液 天津市天力化学试剂有限公司；液氮 宜昌蓝天气体有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒 南京建成生物工程研究所；真菌Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒、引物ITS1、ITS4 上海生工生物工程股份有限公司；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶 宝生物工程（大连）有限公司。

洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；PH-030A型培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MyCycler PCR仪 美国BIO-RAD公司；GDS-8000凝胶成像系统 美国UVP公司；DYCP-31DN型水平电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.2 柑橘采后腐烂优势菌的分离与检测

从宜昌地区自然发病、完全腐烂的柑橘果实挑取孢子接种于PDA培养基中，28℃培养7d，经多次划线分离得纯种菌株。将纯化培养的菌株用无菌水配制成菌悬液，调至105cfu/m L。柑橘果实用2%次氯酸钠溶液浸泡2min，无菌水洗净，用接种针在柑橘果实赤道处对称刺4个直径3mm、深3mm的伤口，在伤口处分别接种20μL孢子悬浮液，晾干，于28℃培养观察果实发病情况［9］。

1.3 致腐菌的分子鉴定

将纯化菌株接种于PDA液体培养基，28℃，120r/m in培养4d后，10000r/m in离心10m in，将菌丝液氮研磨至粉碎，用真菌Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。采用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3'）与ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系：模板DNA 1.0μL，dNTP 2.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，引物各1.0μL，ExTaq酶0.2μL，用ddH2O补至20μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1m in，共33个循环，72℃终延伸10m in。将PCR扩增的ITS片段回收后送往上海生工武汉测序部进行双向测序，测序结果在Genbank进行BLAST比对和同源性分析［10］。

1.4 疏花水柏枝内生菌对致病菌的抑菌作用分析

将淹水胁迫前后有氧或无氧条件下疏花水柏枝的根、茎、叶中分离的内生真菌进行拮抗菌的筛选，用总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒测定，选择12株有高抗氧化活性（＞15U/m L）的内生真菌，经过18S ITS序列比对后确定到属，具体菌株信息见表1。

将纯化的致病菌接种在PDA斜面培养基上，28℃下培养3d，加入9m L无菌水，刮下孢子，将500μL孢子悬液涂布均匀在PDA固体培养基上。用直径8mm的无菌打孔器在生长4d的疏花水柏枝内生真菌菌落边缘切取菌饼，接种至涂布致腐菌的平板上以筛选拮抗真菌，于25℃恒温培养2d，测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 致腐菌的分离及验证

从自然状态下完全腐烂的宜昌本地柑橘上分离出一株致腐菌，该菌生长迅速，自然状态下呈优势生长。经过反复纯化获得单菌落，由图1可见在PDA培养基上菌落呈绒状，圆形，疏松，扁平，生长较快；菌丝体为白色，后形成灰绿色霉层，边缘菌丝带白色，较宽，基质颜色为白色。显微镜检观察其分生孢子串生，呈椭圆形，菌丝分枝且有具横隔（图1）。

图1 致腐菌的形态观察Fig.1 Morphologic character of the rot-causing pathogen

新鲜的柑橘果实在接种菌株致腐菌的孢子悬浮液后，1d后开始发病。2d后在伤口周围形成约2cm的病斑，果皮变软，之后病斑快速扩大，全果变软，表皮开始长出白色菌体，然后其生长出大量的孢子，最后形成灰绿色霉层，果皮变为褐色，相比之下，对照却依旧呈健康的橘黄色。根据柯赫氏法则［11］，判定所分离得到的菌株为柑橘采后腐烂的优势致腐菌。

2.2 致腐菌的分子鉴定

将获得的致腐菌的ITS片段利用特异引物双向测序后，经过DNASTAR软件的拼接，将测序结果（该致腐菌的序列号为KM 496478）在GenBank上进行比对分析，发现三峡地区柑橘采后腐烂的优势致病菌最近源的是镰刀菌属，但是序列同源性不高，与Fusarium culmorum、Fusarium gram inearum、Fusarium cortaderiae、Fusarium acum inatum的同源性只有88%，此外，与赤霉菌属中的Gibberella zeae的同源性也达88%。因此对于三峡地区柑橘的致腐菌还不能确定其种属，但是与前人报到的青霉和绿霉相差甚远。

2.3 疏花水柏枝内生真菌对致病菌的抑菌作用

12株高抗氧化活性的疏花水柏枝内生真菌中有6株对致腐菌有明显抑制效果，分别是QY1、HY1、HG2、SG4、SG5和SG17。其中QY1和SG4的抑菌效果最明显，抑菌圈直径分别达到23.30mm和22.12mm。其抑菌效果的强弱排序为：QY1＞SG4＞HY1＞SG17＞SG5＞HG2（表2）。其中QY1的抗氧化性和抑菌活性都是最强的，但是分析表明，抗氧化性和抑菌活性之间并没有显著的相关性，有些具有较高抗氧化活性的菌株却没有抑菌活性。根据6株具有抑菌效果的内生菌的抗氧化值，两者之间的相关系数只有0.51，因此菌株QY1的筛选综合考虑了抗氧化作用和抑菌作用，对于柑橘的生物保鲜和防腐具有积极的意义。

根据内生菌的来源和三峡地区柑橘致腐菌的抑菌效果，结果表明从疏花水柏枝分离的内生真菌中，共有6株具有抑菌效果，其中4株来自于根，2株来自于叶。淹水前分离的内生菌中，根部有3株、叶部有1株对柑橘致腐菌具有抑菌效应；淹水后分离的内生菌中，根和叶各有1株对柑橘致腐菌具有抑菌效应。说明在具有抑菌效果的疏花水柏枝内生真菌中，淹水前的多于淹水后的；根部的多于叶片的。

表1 供试的12株疏花水柏枝高抗氧化活性内生真菌Table 1 12 endophytes from Myricaria laxiflora and their antioxidant capacity

表2 具高抗氧化能力疏花水柏枝内生真菌对柑橘致病菌的抑制效果Table 2 Antimicrobial activity of endophytic fungi from Myricaria laxiflorawith high antioxidant capacity

3 结论

3.1 从三峡本地自然腐烂的柑橘果实上分离出一株致腐菌，经rDNA-ITS序列分析表明该菌与以往报道的柑橘致腐菌橘青霉和绿霉的差异较大，而和镰刀菌、赤霉菌显示出较近的亲缘关系。

3.2 采用抑菌圈法分析了三峡地区本地物种疏花水柏枝内生真菌对柑橘致腐菌的拮抗作用，结果表明在12株高抗氧化活性的内生菌中，有6株内生真菌具有较好的拮抗效果。对疏花水柏枝淹水前、后内生菌抑菌效果的比较分析表明，淹水前菌株多于淹水后菌株，根部的有效菌多于叶部，其中QY 1显示出较好的抗氧化性和抑菌活性，是一株用在生物保鲜和防腐上很有潜力的菌株。

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Antimicrobial effect of endophytes from Myricaria laxiflora on thefungus causing citrus rot in Three Gorges area

KONG Yu-shan，QIN Tian-m ing，XUE Yan-hong，LIU Shi-ping*
（College of Life Science and Pharmacy，Three Gorges University，Yichang 443002，China）

A dominant fungus was isolated from completely rotten citrus in Three Gorges area. Based on rDNAInternaltranscribed spacer（ITS） analysis，the closest homology of this strain were Fusarium and Gibberella.Meanwhile，the antimicrobial effect of 12 endophytes with high antioxidant capacity from locally Myricarialaxiflora plants was screened by inhibition zone method. Six endophytes showed obvious antimicrobial effect.Particularly，the strain QY1 exhibited the strongest antioxidant and antifungal activity ，indicating that theendophytes from Myricaria laxiflora had a positive effect on biological preservation and anti-corrosion of theThree Gorges citrus.

Myricaria laxiflora；endophytes；citrus；antifungal；antioxidant

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0175-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.027

2014－08－14

孔玉珊（1990-），女，硕士研究生，主要从事微生物的开发与应用方面的研究。

*通讯作者：刘士平（1974-），男，博士，副教授，研究方向：生物防治。

国家自然科学基金（31270389）。