油茶籽壳提取物抗氧化及抗癌活性研究

淦永鉴，李 旭，杨莉琳，丁春邦，曾宪垠，张怀渝，陈志渝，杜小刚

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014）

油茶籽壳提取物抗氧化及抗癌活性研究

淦永鉴，李 旭，杨莉琳，丁春邦，曾宪垠，张怀渝，陈志渝，杜小刚*

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安625014）

目的：观察油茶籽壳不同溶剂提取物（乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、水）体外抗氧化和抗肿瘤活性。方法：采用Folin-Ciocalteu和三氯化铝方法检测总酚及总黄酮含量；采用DPPH法和邻二氮菲-Fe2+氧化法测抗氧化活性；采用CCK-8法测细胞的活性。结果：油茶籽壳乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、水提取物总酚含量分别为79.25±4.552、51.81±3.651、2.762±0.523、19.73±1.191mg/g；总黄酮含量分别为26.73±0.613、15.63±1.126、13.16±0.672、5.734±0.761mg/g；油茶籽壳乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、水提取物在15.625～250μg/mL范围内体外抗氧化活性均具有剂量依赖性；对HepG2细胞增殖抑制作用在62.5～250μg/mL范围内均具有剂量依赖性。结论：体外抗氧化活性和抗肿瘤活性强弱均表现为乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物，其中乙酸乙酯是油茶籽壳提取的有效溶剂。

油茶籽壳，提取物，抗氧化活性，抗肿瘤活性

油茶（Camellia oleifera Abel.）为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，主要分布在我国的长江流域及其以南地区，占地5500万亩，资源丰富［1-2］。茶籽（Camellia oleifera seed）为油茶的成熟种子，茶籽在民间药用历史悠久，为民间习惯用品。茶籽壳（Camellia oleifera shell）为茶籽榨油后的副产物，是茶籽榨油前除去的种皮，其利用率却相对较低。现代药理研究发现，茶籽壳中富含茶皂素［3］、黄酮［4］、多糖［5］、多酚［6］等成分，具有减肥［7］、降血糖［8］、改良性前列腺增生症［9］等功效。若能将茶籽壳加以有效利用，必将产生巨大的经济效益。

目前油茶的研究主要集中在茶籽上，关于茶籽壳研究报道还很少［5-6］，特别是茶籽壳抗氧化和抗肿瘤方面的研究。因此本研究观察油茶籽壳不同溶剂提取物的体外抗氧化活性以及对人宫颈癌细胞株（HeLa）和人肝癌细胞株（HepG2）增殖的影响，从而为发掘油茶籽壳的新用途奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶籽壳 采于四川雅安市雨城区，经四川农业大学生命科学学院丁春邦教授鉴定；没食子酸标准品、芦丁标准品、Folin-Ciocalteu试剂、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH、1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）、邻二氮菲（1，10-Phenanthriline）、二甲基亚砜（DMSO） 美国sigma公司；DMEM干粉培养基、胰蛋白酶 美国Gibco公司；胎牛血清 美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司；人宫颈癌细胞株（HeLa）、人肝癌细胞株（HepG2） 由四川大学生物材料技术中心赠，在本实验室正常传代三次；其余试剂 均为国产分析纯。

UV-1750紫外分光光度计 日本Shimadzu；Synergy HT酶标仪 美国BIO-TEK；Sorvall ST 16R离心机、二氧化碳培养箱 美国Thermo；MLS-3780高压灭菌锅 日本Sanyo；RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器；DZF型真空干燥箱 北京市永光明医疗器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油茶籽壳不同提取物的制备 油茶籽壳经烘干，粉碎，过100目筛，备用。油茶壳粉末以1∶20（w/v）料液比用70%乙醇于50℃浸提2h，浸提3次，浸提液经旋转蒸发仪50℃浓缩为浸膏，真空干燥。干燥的乙醇提取物溶于100m L双蒸水中，用100m L丙酮沉淀部分皂苷后，浓缩、干燥；再溶于250m L双蒸水中；按浸提液与萃取溶剂1∶1（v/v）依次经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇室温萃取过夜，再50℃旋转蒸发浓缩为浸膏、真空干燥。最终获得氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相提取物。

1.2.2 细胞培养 人宫颈癌细胞株（HeLa）、人肝癌细胞株（HepG2）由四川大学生物材料技术中心赠，在本实验室正常传代三次。HeLa和HepG2细胞株用10%胎牛血清的DMEM培养液，同时加入100U/m L链霉素和100U/m L青霉素，于37℃、5%CO2培养箱中饱和湿培养，每2～3d换液1次。

1.2.3 油茶籽壳不同提取物总多酚和总黄酮含量测定 总多酚类物质测定采用Yang等［10］所描述的Folin-Ciocalteu试剂法。依次加入0.5m L 250μg/m L提取物，2.5m L 0.2NFolin-Ciocalteu试剂，室温反应5m in，再加入2m L 7.5%Na2CO3溶液，混匀，室温反应1h，于765nm测定吸光度。没食子酸标准曲线Y=6.412x+0.009（R2= 0.998），根据标准曲线计算总酚含量。

总黄酮物质的测定采用Barreira JCM等［11］所描述的三氯化铝法。将0.4m L 1mg/m L提取物溶于2m L 30%乙醇中，再加入1.6m L 1%三氯化铝溶液，摇匀放置10min，于415nm测定吸光度。芦丁标准曲线Y= 3.824x-0.003（R2=0.999），根据标准曲线计算总黄酮含量。

1.2.4 油茶籽壳不同提取物体外抗氧化分析

1.2.4.1 油茶籽壳不同提取物对DPPH自由基的清除能力 采用Yang等［12］描述的方法，依次加入2m L的2×10-4mol/L的DPPH无水乙醇液，2m L各组提取物（31.25、62.5、125、250μg/m L），混匀，室温下放置30m in后，于517nm处测得吸光值Ai，同时测定DPPH无水乙醇液与2m L无水乙醇混合液的吸光值Ao，以及2m L提取物与2m L无水乙醇混合液的吸光值Aj，DPPH自由基清除率（Y1）的计算公式：

1.2.4.2 油茶籽壳不同提取物对羟基自由基的清除能力 采用Su等［13］所描述的邻二氮菲-Fe2+氧化法，依次加入0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液2m L于试管中，再加入PBS缓冲液（pH=7.4 0.1mol/L）4m L和蒸馏水2m L，充分摇匀后，加0.75mmol/L FeSO4溶液2m L，混匀，加0.01%H2O2溶液2m L，在37℃水浴中放置60min，于536nm处测得吸光度Ap。蒸馏水代替0.01% H2O2溶液，测得吸光值Ab。蒸馏水用各组提取物（15.625、31.25、62.5、125μg/m L）代替，测得吸光值As。羟基自由基清除率（Y2）的计算公式：

1.2.5 CCK-8法测定油茶籽壳不同提取物对人肿瘤细胞的影响 取处于指数生长期的HeLa细胞株和HepG2细胞株各一瓶，制成细胞悬液，分别以细胞密度1×104个/孔和0.5×104个/孔100μL接种在96孔培养板中，同时加入用含0.25%二甲基亚砜（DMSO）的DMEM完全培养基配制各组提取物（62.5、125、250和500μg/m L）100μL，空白对照组和0.25%DMSO对照组加入不含样品的培养液100μL。在5%CO2、37℃饱和湿度下孵育24h后，每孔加入20μL CCK-8溶液，继续孵育4h，于450nm测定吸光度。实验组，记A1；空白对照组，记A2；计算抑制率和IC50值。抑制率计算公式：

抑制率（%）=（1－A2/A1）×100

1.3 统计方法

2 结果与分析

2.1 油茶籽壳不同提取物中总酚和总黄酮的含量

油茶壳提取物中总酚的含量，见表1，结果显示各组分总酚含量两两之间差异显著（p＜0.05），总酚含量高低依次为：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物。

油茶壳提取物中总黄酮的含量，见表1，结果显示各组分两两之间差异显著（p＜0.05），总黄酮含量高低依次为：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞氯仿提取物＞水提取物。可见，黄酮类化合物主要集中在极性较弱的乙酸乙酯提取物中，含量比水提物提高了近5倍。Mir Z Gul等［14］对相思豆（Abrus precatorius）提取物进行体外抗氧化和抗肿瘤研究，乙酸乙酯提取物表现出较强的抗氧化活性和抗肿瘤活性，且乙酸乙酯提取物中的总酚和总黄酮含量也较其他组高。

表1 油茶籽壳不同提取物中化学成分含量分析Table 1 Analysis of the phytochemicals component of different extracts of Camellia oleifera shell

2.2 油茶籽壳不同提取物对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一种稳定的自由基，其孤对电子在715nm处有特征强吸收（深紫色）。抗氧化剂可直接与孤对电子配对，使DPPH自由基吸收减弱，颜色从紫色逐渐变为黄色，因此可以通过测定吸收减弱的程度，间接评价该抗氧化剂的活性［15］。各组提取物对DPPH自由基清除率的实验结果见表2。各组提取物对DPPH自由基的清除作用在31.25～250μg/m L具有浓度依赖性。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物、氯仿提取物对DPPH自由基的半清除率IC50值见表2。对比IC50，清除作用最强的是乙酸乙酯提取物，其对DPPH自由基的清除率较正丁醇提取物无显著差异（p＞0.05），较水提取物差异显著（p＜0.05），较氯仿提取物差异极显著（p＜0.01）。

表2 油茶籽壳不同提取物不同浓度对DPPH自由基的影响Table 2 Scavenging effects of the various extractions from Camellia oleifera shell on DPPH radical at the different concentrations

2.3 油茶籽壳不同提取物对羟基自由基的清除能力

邻二氮菲-Fe2+氧化法是一种羟基自由基清除能力的测定方法，它以邻二氮菲-Fe2+为氧化还原指示剂，因其呈色的变化而反映出溶液中氧化还原状态的改变。体系中通过Fenton反应产生的HO-可使邻二氮菲-Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失［16］。各组提取物对羟基自由基清除率的实验结果见表3。其中乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对羟基自由基的清除作用在15.625～125μg/m L具有浓度依赖性；求出乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对羟基自由基的半清除率IC50值见表3；氯仿提取物对羟基自由基的清除作用在15.625～125μg/m L不具有浓度依赖性，IC50值不能求出。

表3 油茶籽壳不同提取物不同浓度对羟基自由基的影响Table 3 Scavenging effects of the various extracts from Camellia oleifera shell on hydroxyl radical at the different concentrations

陈亚琪等［17］对油茶浦提取物的抗氧化活性研究发现，总酚含量与抗氧化能力间存在较好的相关性。本研究油茶籽壳不同提取物总酚含量与其清除DPPH自由基IC50的相关系数为0.983，对羟基自由基IC50的相关系数也达到0.885。可以认为，多酚类物质是油茶籽壳提取物清除自由基及抗氧化的主要成分，在生物体系中相关性明显。

2.4 油茶籽壳不同提取物对人宫颈癌细胞株（HeLa）增殖的影响

CCK-8试剂中含有WST-8［2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐］，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

不同提取物对人宫颈癌细胞株（HeLa）增殖的影响实验结果见图1，0.25%DMSO对HeLa细胞株不会产生伤害作用。氯仿提取物62.5～125μg/m L和水提取物62.5μg/m L剂量组与空白对照组比，未见显著性差异（p＞0.05），而氯仿250～500μg/m L剂量组与空白对照组相比差异显著（p＜0.05），水提取物125～500μg/m L各剂量组与空白对照组相比差异显著（p＜0.05）。乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在62.5～250μg/m L剂量范围内对HeLa细胞增殖的抑制呈剂量依赖性，其中250μg/m L的抑制率最高分别为81.99%和91.53%。

图1 油茶籽壳不同提取物不同浓度对HeLa细胞生长的影响Fig.1 Effect of the various extracts from Camellia oleifera shell at the different concentrations on HeLa cells after the cells were cultured

2.5 油茶籽壳不同提取物对人肝癌细胞株（HepG2）增殖的影响

不同提取物对人肝癌细胞株（HepG2）增殖的影响结果见图2，0.25%DMSO对HepG2细胞株未产生伤害作用。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和氯仿提取物在62.5～500μg/m L剂量范围内对HepG2细胞增殖的抑制呈剂量依赖性，其中500μg/m L的抑制率均最高，分别为92.56%、95.67%和94.47%。水提取物在62.5～ 250μg/m L剂量范围内对HepG2细胞增殖的抑制呈剂量依赖性，在250μg/m L时抑制率最高为93.19%。

图2 油茶籽壳不同提取物不同浓度对HepG2细胞生长的影响Fig.2 Effect of the various extracts from Camellia oleifera shell at the different concentration on HepG2 cells after the cells were cultured

2.6 油茶籽壳不同提取物对不同肿瘤细胞增殖影响的差异性分析

油茶籽壳氯仿提取物和水提取物在125μg/m L浓度以下对HeLa和HepG2肿瘤细胞增殖的抑制作用均较弱，在250μg/m L以上时各提取物组分均表现出对肿瘤细胞较强的抑制作用。对2种肿瘤细胞的IC50值大小顺序均为：油茶籽壳氯仿提取物＞水提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物，见表4。这与唐玲等［18］对油茶籽提取物的体外抗癌活性体外增殖抑制作用的强弱为油茶籽乙醇提取物＞水提取物研究结果一致。

表4 油茶籽壳不同提取物对HeLa和HepG2细胞株IC50的比较Table 4 Comparison of IC50of different extracts from Camellia oleifera shell on HeLa and HepG2 cell lines

3 结论

本文对油茶籽壳提取物进行了主要活性成分、抗氧化和抗肿瘤分析，结果表明乙酸乙酯提取物中多酚含量为（79.25±4.552）mg/g，黄酮含量为（26.73± 0.613）mg/g，高于其他提取物；体外抗氧化活性和抗肿瘤活性强弱均表现为乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物。油茶籽壳乙酸乙酯提取物有明显的抗氧化活性和抗肿瘤活性，这为继续开发高效低毒的新型天然抗氧化和抗肿瘤药物奠定了坚实的基础。

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In vitro antioxidant and antiproliferative activities of the different extracts from shell of Camellia oleifera Abel.

GAN Yong-jian，LIXu，YANG Li-lin，DING Chun-bang，ZENG Xian-yin，ZHANG Huai-yu，CHEN Zhi-yu，DU Xiao-gang*
（College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China）

Objective:The paper investigated antioxidant and antiproliferative properties of various extracts （EthylAcetate，N-butanol，Chloroforms，Aqueous） from the shells of Camellia Oleifera Abel. with in vitro. Methods:Total phenolics and total flavonoids were measured by Folin-Ciocalteu reagent and aluminium chloridereagent，respectively. And，the antioxidant activity was tested by DPPH and hydroxyl assays in vitro. Besides，the proliferative activity of the different human cancer cell lines was detected by CCK-8 assay. Results:Totalphenolic contents of extracts （Ethyl Acetate，N-butanol，Chloroforms，Aqueous） were （79.25±4.552）mg/g，（51.81±3.651）mg/g，（2.762±0.523）mg/g，（19.73±1.191）mg/g respectively，and total flavonoid contents were（26.73±0.613）mg/g，（15.63±1.126）mg/g，（13.16±0.672）mg/g，（5.734±0.761mg/g，respectively. The antioxidantactivities of these extracts in a range of concentrations from 15.625 to 250μg/mL increased in dose-dependentmanner. More over，the antiproliferative activities of these extract in a range of concentrations from 62.5 to250μg/mL increased in dose-dependent manner. Conclusion:Antioxidant and antiproliferative activities strengthof Ethyl acetate extracts＞N-butanol extracts＞Aqueous extracts＞Chloroform extracts in vitro，Ethyl acetate wasan effective solvent to extract shell of Camellia oleifera Abel.

Camellia oleifera shell；extracts；antioxidant；antiproliferative

TS201.4

A

1002-0306（2015）08-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.026

2014－06－09

淦永鉴（1986-），男，硕士研究生，研究方向：分子生物物理学。

*通讯作者：杜小刚（1977-），男，博士，副教授，研究方向：细胞免疫学。

四川省肉类加工实验室开放基金（13-R04）。