黑莓籽总多酚、总黄酮含量及其抗氧化活性

张 伟，尹震花，张 勇，康文艺

（黄河科技学院，河南郑州450063）

黑莓籽总多酚、总黄酮含量及其抗氧化活性

张 伟，尹震花，张 勇，康文艺*

（黄河科技学院，河南郑州450063）

采用清除DPPH自由基、ABTS自由基及铁离子还原能力法评价黑莓籽体外抗氧化活性，Folin-Ciocalteau法测其总多酚含量，NaNO2-AlCl3比色法测定其总黄酮含量，相关系数法分析其总多酚、总黄酮与抗氧化活性间的相关性。结果显示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有强的DPPH自由基［IC50=（41.93±4.05）、（64.75±5.89）μg/mL］和ABTS自由基［IC50=（2.91±0.46）、（3.18±1.01）μg/mL］清除活性，较强的铁离子还原能力［Trolox当量=（2348.73±2.78）、（1262.55± 31.58）μmol/g］，石油醚部位具有ABTS自由基［IC50=（21.85±0.61）μg/mL］清除活性和较弱的铁离子还原能力［Trolox当量=（123.59±10.01）μmol/g］。3个部位总多酚、总黄酮含量与清除ABTS自由基能力之间存在一定的相关性（R2分别为0.6832、0.2596）；总多酚含量与还原铁离子能力（Trolox当量）之间存在一定的相关性（R2=0.990）。可见，黑莓籽具有良好的抗氧化活性。

黑莓籽，抗氧化活性，总多酚，总黄酮

黑莓（Rubus spp.Blackberry）为蔷薇科（Rasaceae）悬钩子属聚合果类植物，果实营养价值和药用价值高，主要作为加工型水果［1-2］。具有清除自由基、延缓衰老、增强免疫力等功能，特别具有降低胆固醇含量、防治心脏疾病、抗癌（降低化疗引起的毒副作用）和抗血栓的功效［3-5］。

黑莓籽是黑莓果酒和果汁等产品的副产物，具有丰富的黄酮、多酚类和花青素等天然活性成分，是黑莓综合利用的一个重要部分。参阅文献发现，对于四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠，黑莓籽石油醚部位和乙酸乙酯部位及黑莓籽油具有体内纠正脂质代谢紊乱和增强机体抗氧化防御体系的能力［6］；对于高血脂小鼠，黑莓籽石油醚部位和正丁醇部位及黑莓籽油具有一定程度的调节脂质代谢和抗脂质过氧化，改善脂质在小鼠肝脏和脾中的蓄积，减少氧化应激［7］的作用；对于四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤，黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油的抗氧化机制是其保肝作用机制之一［8］；蒋彩云等发现黑莓籽的总提取物具有清除DPPH自由基和氧自由基的作用［9］；陈欣欣研究发现，黑莓渣中提取出的多酚类化合物有较强的还原能力，能够抑制脂质体过氧化，具有清除·OH、O2·-和DPPH·的活性，且其多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间有良好的量效关系［10］。但有关黑莓籽不同极性部位的抗氧化活性及其总多酚和总黄酮的含量的研究还未见报道。本文采用不同溶剂对黑莓籽进行提取，得到3个极性不同的部位，同时测定样品中总多酚和总黄酮的含量，清除DPPH和ABTS自由基及铁离子还原能力，观察它们之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑莓籽 2013年7月购买于河南省封丘县，由河南大学天然药物研究所李昌勤教授鉴定为蔷薇科（Rasaceae）悬钩子属聚合果类植物黑莓（Rubus spp. Blackberry）籽，标本存于黄河科技学院天然药物研究所；1，1-二苯基-2-苦酰基自由基（DPPH） 日本东京化成工业株式会社；Fe3+-三吡啶三哑嗪（TPTZ）、二丁基羟基甲苯（BHT） 比利时AcrosOrganics公司；2，2′-连氨-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS） 美国Fluka公司；Trolox（6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid） Aldrich公司；邻苯二酚 北京化学试剂公司；斐林酚试剂Merck公司；芦丁标准品 河南大学天然药物研究所提供，纯度98%；其他试剂 均为分析纯。

UV-2000型紫外可见分光光度计 尤尼可上海仪器有限公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；MultiskaMK3酶标仪 美国Thermo Electron公司；旋转蒸发仪 德国Heidolph公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取及配制 黑莓籽粉末，用50L石油醚冷浸4次，每次3d脱脂；脱脂后的残渣挥干石油醚后，加入40L 70%乙醇冷浸3次，每次3d，浓缩、回收乙醇得到乙醇总浸膏。总浸膏分散于水中，依次用500m L石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取4次，得黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

分别称取3个部位样品4mg，加入2m L的甲醇，80Hz超声30m in溶解，配成所需浓度的样品用于抗氧化活性和含量的测定。

1.2.2 抗氧化活性测定

1.2.2.1 清除DPPH自由基能力的测定 参考文献［11］的方法，按公式（1）计算DPPH自由基清除率。每份样品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol为DPPH本身在测定波长的吸收度，Asample为样品对DPPH作用后的吸收度数值（除去样品自身吸收）。

1.2.2.2 清除ABTS自由基能力的测定 参考文献［12］的方法，按公式（2）计算ABTS自由基清除率。每份样品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol为ABTS自由基本身在测定波长的吸收度，Asample为样品对ABTS自由基作用后的吸收度数值（除去样品自身吸收）。

1.2.2.3 铁离子还原能力（FRAP）的测定 参考文献［13］酶标仪的方法测定黑莓籽铁离子还原能力。

1.2.2.4 数据处理 依据上述公式计算得到的清除率，用Origin 8.0软件处理，得到样品清除DPPH自由基和ABTS自由基的半数清除率IC50值。

1.2.3 总多酚和总黄酮的含量测定

1.2.3.1 总多酚的含量测定 在参考文献［14］的基础上，A lCl3代替A l（NO3）3，改进反应时间、测定波长和体积，于510nm处测定吸光度。以吸光度（Y）对邻苯二酚浓度（X，mg/m L）作图，得邻苯二酚标准曲线，计算黑莓籽三个部位的总多酚含量。

1.2.3.2 总黄酮的含量测定 在参考文献［15］的基础上，改进反应时间、测定波长和体积，于765nm处测定吸光度。以吸光度（Y）对芦丁浓度（X，mg/m L）作图，得芦丁标准曲线，计算黑莓籽三个部位总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除活性

以各样品质量浓度为自变量，对DPPH自由基清除率为因变量进行曲线拟合，结果如图1所示。在选定的质量浓度范围内（6.76～108.11μg/m L）内，乙酸乙酯部位和正丁醇部位对DPPH清除率几乎呈线性关系增加，进行线性拟合，结果表明线性关系较好，R2分别为0.9672和0.999。在初筛浓度108.11μg/m L时，石油醚部位对DPPH自由基的清除率低于50%，故IC50未测定，故没有石油醚部位的数据。

图1 提取物质量浓度对DPPH自由基的影响Fig.1 Effectofmass concentration of extracts on DPPH free radical

在DPPH自由基清除实验中，通过上述线性拟合方法得到乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除DPPH自由基的IC50值分别为（41.93±4.05）和（64.75±5.89）μg/ m L，结果见表1。与阳性对照BHT相比，正丁醇部位活性比BHT弱（p＜0.05）。乙酸乙酯部位具有较强的清除DPPH自由的能力，且与BHT相当，无显著性差异（p＞0.05）。

表1 黑莓籽不同部位的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of different extracts from blackberry seed

2.2 ABTS自由基清除活性

ABTS是一种水溶性的自由基引发剂，经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·，向其中加入被测物质，当待测物质中含有抗氧化成分时，该物质会与ABTS+·发生反应而使反应体系颜色褪去，此时ABTS+在734nm处有最大吸收。利用此原理进行样品清除ABTS自由基能力的测定。

以各样品质量浓度为自变量，对ABTS自由基清除率为因变量进行曲线拟合，如图2所示。由图2可见，在5.95～47.62μg/m L范围内，石油醚部位对ABTS清除率几乎呈线性关系增加，进行线性拟合，其线性关系较好，R2为0.9784，当浓度超过47.62μg/m L，对ABTS自由基的清除缓慢增加。在1.49～11.91μg/m L范围内，乙酸乙酯部位和正丁醇部位对ABTS清除率几乎呈线性增加，线性拟合结果表明线性关系较好，R2分别为0.9296和0.9806。当质量浓度为11.91μg/m L时，乙酸乙酯部位和正丁醇部位对ABTS清除率分别达到了98.57%和99.01%，此后清除率几乎不变。

图2 提取物质量浓度对ABTS自由基的影响Fig.2 Effect ofmass concentration of extracts on ABTS free radical

在ABTS自由基清除实验中，通过上述线性范围内的拟合方法得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除ABTS自由基的IC50值分别为（21.85± 0.61）、（2.91±0.46）和（3.18±1.01）μg/m L，结果见表1。与阳性对照BHT相比，三个部位与BHT之间均具有显著性差异（p＜0.05），其中石油醚部位清除ABTS自由基的IC50值大于BHT，乙酸乙酯、正丁醇部位小于BHT。由此可见，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有较强的清除ABTS自由基的能力，且强于BHT，石油醚部位清除ABTS自由基的能力弱于BHT。

2.3 铁离子还原能力

目前，测定铁离子还原能力的方法有Fe3+-三吡啶三哑嗪和铁氰化钾法。范金波等［16］采用这两种方法测定了绿咖啡豆提取物还原铁离子能力，结果显示，两种实验方法得到的结果一致，但对比发现，Fe3+-三吡啶三哑嗪法较铁氰化钾法更灵敏且操作也更简单，缺点是成本高。本实验采用酶标仪建立了Fe3+-三吡啶三哑嗪微量法，试剂用量少，降低了实验成本。

在低pH的溶液中，Fe3+可被抗氧化剂还原为Fe2+，呈现出明显的蓝色，并在595nm处有最大吸收，根据此原理测定黑莓籽样品铁离子还原能力。结果以相对于Trolox抗氧化剂的能力来表示。

黑莓籽3个部位对铁离子还原能力结果见表1。由表1可以看出，与阳性对照BHT比较，石油醚部位还原铁离子能力弱于BHT（p＜0.05）；而乙酸乙酯部位强于BHT（p＜0.05）；正丁醇部位与BHT相当（p＞0.05）。三者还原能力依次为：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。

2.4 总多酚、总黄酮含量与其体外抗氧化相关性分析2.4.1 各部位总多酚、总黄酮的含量 各部位总多酚、总黄酮的含量绘制总多酚和总黄酮含量的标准曲线，以吸光度（Y）对邻苯二酚浓度（X，g/m L）作图，得邻苯二酚标准曲线，Y=0.119X-0.049（R2=0.9970）；以吸光度（Y）对芦丁浓度（X，g/m L）作图，得芦丁标准曲线，Y=0.009X-0.004（R2=0.999），以此计算黑莓籽3个部位中总多酚和总黄酮的含量结果见表2。

表2 黑莓籽不同部位总多酚和总黄酮含量Table 2 Contents of total phenols and total flavonoids different extracts from blackberry seed

由表2可以看出，乙酸乙酯部位较石油醚部位和正丁醇部位总多酚含量高，三者之间具有显著性差异（p＜0.05）；石油醚部位和乙酸乙酯部位较正丁醇部位总黄酮含量高，除石油醚和乙酸乙酯部位之间差异不显著外（p＞0.05），其余两组均差异显著（p＜0.05）。

结合表1数据可以综合分析，石油醚部位抗氧化能力与总多酚含量高低有关；乙酸乙酯部位中总多酚和总黄酮含量均高于正丁醇部位，且乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力（IC50值）大于正丁醇部位，可见，乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除DPPH自由基的能力与其总多酚和总黄酮含量高低有关。

2.4.2 体外抗氧化相关性分析 以清除ABTS自由基活性（IC50）对总多酚（或总黄酮）含量（%）作图，得体外清除ABTS自由基相关性；以还原铁离子能力（Trolox当量）对总多酚（或总黄酮）含量（%）作图，得体外还原铁离子能力相关性，结果见表3。

表3 体外抗氧化相关性分析Table 3 In vitro antioxidant correlation analysis

由表3数据相关系数（R2）可以看出，清除ABTS自由基能力与总多酚含量之间的相关性高于与总黄酮含量之间的相关性，还原铁离子能力与总多酚含量的相关性最高（R2=0.990），而还原铁离子能力与总黄酮含量之间的相关性系数低于0.01。

3 讨论

多种疾病，如糖尿病、肝损伤、心脏病、癌症、风湿性关节炎等的发生和发展过程中，都出现了自由基的增多和抗氧化能力的减弱［17-18］。因此天然抗氧化成分日益成为国内外研究热点。由于果蔬、新鲜食品中的抗氧化活性物质种类复杂，导致极性、溶解性等不同；此外，虽然体外抗氧化机理只有单电子转移和氢原子转移，但抗氧化评价方法多且不统一，使目前食品中抗氧化能力的计算方法没有统一的标准［19］；另外，同一种样品中会有多种抗氧化物质同时存在，在一定程度上会出现协同抗氧化作用［20］。因此，对于同一个样品，应采用三种及其以上抗氧化方法综合评价抗氧化活性。本文采用三种抗氧化方法，测定了黑莓籽不同极性部位的抗氧化活性。由结果可以看出，黑莓籽3个部位对DPPH和ABTS自由基及还原铁离子能力具有相同的趋势，即：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。

研究证明，天然植物中黄酮类和多酚类成分的含量与其抗氧化能力有很强的相关性。其中，酚类化合物具有多种功能，能够成为自由基终止剂、金属螯合剂和单线态氧淬灭剂，其清除能力主要通过其羟基实现的［21］。黄酮类化合物由于具有酚羟基，在很早就被认为是最主要的抗氧化剂，能够延缓或者抑制脂质过氧化和氧化链反应［22］，两者虽然都含有酚羟基，但是其作用机理有一定的区别。参阅文献发现，黑莓的抗氧化性与总酚含量有很强的相关性［23］；黑莓渣中提取出的多酚类化合物有较强的还原能力，具有清除OH、O2-和DPPH自由基的活性，且其多酚类化合物的抗氧化活性与其浓度之间有良好的量效关系［10］。本文研究发现黑莓籽总多酚与抗氧化能力之间存在很高的相关性，总黄酮与抗氧化能力之间的相关性则相对较低，这与黑莓或黑莓渣的研究文献结果一致。可见，黑莓、黑莓渣或黑莓籽的抗氧化活性主要与其总多酚的含量有关。

4 结论

黑莓籽乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性及还原铁离子能力；石油醚部位具有ABTS自由基清除活性和较弱的铁离子还原能力。3个部位总多酚、总黄酮含量与清除ABTS自由基能力之间存在一定的相关性（R2分别为0.6832、0.2596）；总多酚含量与还原铁离子能力之间存在一定的相关性（R2=0.990）。可见，黑莓籽具有开发功能食品的应用前景。

［1］Wang SY，Lin H S.Antioxidant activity in fruit and leaves of blackberry，raspberry，and strawberry is affected by cultivar and maturity［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（2）：140-146.

［2］Wang S Y，Jiao H.Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals，hydrogen peroxide，hydroxyl radicals，and singlet oxygen［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（11）：5677-5684.

［3］尹震花，王佳佳，顾海鹏，等.黑莓（萨尼）果实体外抗氧化活性研究［J］.天然产物研究与开发，2013，25（4）：530-532.

［4］Elisia I，Hu C，Popovich DG，etal.Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract［J］.Food Chemistry，2007，101（3）：1052-1058.

［5］Bowen-ForbesCS，Zhang Y J，NairM G.Anthocyanin content，antioxidant，anti-inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（6）：554-560.

［6］张伟，尹震花，彭涛，等.黑莓籽对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的影响［J］.食品工业科技，2014，35（19）：351-358.

［7］尹震花，张伟，冯发进，等.黑莓籽降血脂有效部位研究［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（24）：194-198.

［8］张伟，尹震花，冯发进，等.黑莓籽保护急性肝损伤的有效部位研究［J］.食品科技，2014，39（12）：94-97.

［9］蒋彩云，李小华，苏烁.黑莓籽抗氧化面膜的制备［J］.江苏调味副食品，2013（3）：13-16，28.

［10］陈欣欣，许时婴.黑莓渣提取物中多酚类化合物抗氧化活性的研究［J］.食品工业，2007（3）：3-6.

［11］王丽，张丽，康文艺.芦丁清除DPPH自由基微量模型建立［J］.食品工业科技，2013，30（4）：96-98.

［12］卢引，李光勇，魏金凤，等.清除ABTS自由基微量模型的建立［J］.天然产物研究与开发，2013，25（11）：1533-1535.

［13］卢引，尹震花，康文艺.FRAP法微量模型的建立［J］.食品工业科技，2009，34（5）：312-314.

［14］Sharma P，Gujral H S，Singh B.Antioxidant activity of barley as affected by extrusion Cooking［J］.Food Chemistry，2012，131（4）：1406-1413.

［15］LiX，Lin J，HanW，etal.Antioxidant Ability and Mechanism of Rhizoma Atractylodes macrocephala［J］.Molecules，2012，17（11）：13457-13487.

［16］范金波，蔡茜彤，冯叙桥，等.绿咖啡豆提取物的抗氧化性研究［J］.食品工业科技，2014，35（9）：72-77.

［17］Sameh A Z，Amany S.Hepatoprotective and antioxidant activities of Tamarix nilotica flowers［J］.Pharmaceutical Biology，2011，49（4）：392-395.

［18］Halliwell B.Free radicals，antioxidants，and human disease：Curiosity，cause，or consequence［J］.Lancet，1994，344（8924）：721-724.

［19］李洋，马文平，倪志婧.宁夏枸杞体外抗氧化机理研究［J］.食品科学，2014，35（1）：79-84.

［20］Parker T L，Miller S A，Myers L E，et al.Evaluation of synergistic antioxidant potential of complexmixtures using oxygen radical absorbance capacity（ORAC）and electron paramagnetic resonance（EPR）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（1）：209-217.

［21］Yasmin S，Kashmiri A，Asghar N，et al.Antioxidant potential and radical scavenging effects of various extracts from Abutilon indicum and Abutilonmuticum［J］.Pharmaceutical Biology，2010，48（3）：282-289.

［22］AndlauerW，Furst P.Antioxidative power of phytochemicals with special reference to cereals［J］.Cereal Food World，1998，43（5）：356-360.

［23］Prior P L，Cao G H，Martin A，etal.Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content，maturity，and variety of vaccinium species［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（7）：2686-2693.

Contents of total plyphenols and total flavones and antioxidant activity of blackberry seed

ZHANG W ei，YIN Zhen-hua，ZHANG Yong，KANGW en-yi*
（Huanghe Science and Technology College，Zhengzhou 450063，China）

DPPH，ABTS and ferric ion reducing power methods were used to evaluate in vitro antioxidant activity of blackberry seed.The content of polyphenols was measured using the Folin-Ciocalteau method，and the content of total flavones was measured using the NaNO2-AlCl3colorimetric method.Correlation between polyphenol and flavone contents and antioxidant capacity was analyzed.The results showed that ethyl acetate extract and n-butanol extract from blackberry seed had DPPH［IC50=（41.93±4.05），（64.75±5.89）μg/m L，respectively］and ABTS radical scavenging activity［IC50=（2.91±0.46），（3.18±1.01）μg/m L，respectively］，and ferric ion reducing power［Trolox equivalent=（2348.73±2.78），（1262.55±31.58）μmol/g，respectively］.Petroleum ether extract had ABTS radical scavenging activity［IC50=（21.85±0.61）μg/m L］and weak ferric ion reducing power［Trolox equivalent=（123.59±10.01）μmol/g］.An excellent correlation between ABTS rad ical scavenging activity of three extracts and the contents of total polyphenols and total flavones were observed（R2=0.6832 and 0.2596）.Ferric ion reducing power was correlated with the content of total polyphenols（R2=0.990）.Blackberry seed had antioxidant activity.

b lackberry seed；antioxidant activity；total polyphenols；total flavones

TS255.1

A

1002-0306（2015）08-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.016

2014－07－30

张伟（1974-），男，硕士，副教授，主要从事中药活性成分方面的研究。

*通讯作者：康文艺（1971-），男，博士，教授，主要从事中药活性成分及西药开发方面的研究。

郑州市科技局科技攻关计划（20120684，20140790）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划（2013GGJS-220）；河南省科技厅重点攻关项目（142102310147）。